罗 川，喻支梁，张万年，缪震元（. 安徽华润金蟾药业股份有限公司，安徽 淮北 35000；. 海军军医大学药学院药物化学教研室，上海 00433）

神经前体细胞发育性表达下调8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8，NEDD8)是细胞中具有重要生物学功能的类泛素蛋白，能调节cullin-ring E3连接酶的活性，控制多种肿瘤细胞生长相关蛋白CDT1、cyclin E、p27和NRF2等的转归。NEDD8活化酶 (NEDD8-activating enzyme，NAE)是NEDD8信号通路的关键酶，能催化NEDD8蛋白与ATP的结合。抑制NAE的活性，能够降低泛素-蛋白酶体系统(UPS)通路的活性和相关蛋白的降解，诱导肿瘤细胞凋亡[1-3]。MLN4924是首个报道的选择性小分子NAE抑制剂，目前已进入临床Ⅰ期研究，用于治疗黑素瘤、急性髓细胞性白血病和实体瘤。MLN4924的成功发现使得基于NEDD8信号通路进行抗肿瘤药物研究成为研究热点之一，先后报道多个全新骨架的小分子抑制剂，其中包括源于天然产物的磺酰胺化合物2和三环类化合物3[4-7](图1)。近年来，NAE突变(A171T)的发现使得有必要研发新型的NAE抑制剂[8]。

骨架跃迁策略是药物设计领域的常见思路之一，也已获得很多成功的案例。笔者基于MLN4924的结构，采用骨架跃迁策略将药物中的优势骨架吲唑环引入到MLN4924的结构中，设计出一类非核苷类NAE抑制剂。

1 仪器与试剂

核磁共振仪为Bruker 300或600型，TMS为内标，CD3OD、DMSO-d6或者CDCl3为溶剂。化学位移（δ）和偶合常数（J）分别以ppm和Hz为单位，在API-3000LC-MS型质谱仪上完成ESI质谱。TLC分析所用硅胶板为GF254（中国青岛海洋化学）；硅胶柱层析采用60G硅胶（中国青岛海洋化学）。商品化溶剂皆为市售分析纯或化学纯。

2 实验方法

2.1 4-硝基-1H-吲唑 (5)的合成

将1.51 g（9.8 mmol）2-甲基-3-硝基苯胺溶于37.5 ml冰醋酸。然后，将0.82 g亚硝酸钠（12.0 mmol）溶于3.5 ml 水，加入上述反应液中，室温反应8 h。将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，干燥后重结晶得1.07 g黄色晶体，收率66.9%。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.92 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.16(d,J= 7.68 Hz, 1H), 8.10 (d,J= 8.14 Hz, 1H), 7.61( t,J= 8.02 Hz, 1H)；ESI-MS (m/z): 164.2 (M+H+)。

2.2 N-(4-氟苄基)-1H-吲唑-4-胺 (7)的合成

将4.02 g 4-硝基-1H-吲唑（5）溶于60 ml甲醇，加入1.02 g 10%钯碳，室温催化氢化反应2 h，过滤，浓缩得3.20 g 4-氨基吲唑（6）。将1.6 g（12.0 mmol）化合物6溶于25 ml甲醇，然后滴加1.93 ml（18.0 mmol）4-氟苯甲醛，室温反应1 h，然后，缓慢加入909.5 mg（24.1 mmol）硼氢化钠，室温下反应30 min，蒸去溶剂，二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，柱层析得1.2 g褐色固体，收率41.6%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.70 (s, 1H), 8.19 (s,1H), 7.40 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 7.12(t,J=15.0 Hz, 2H),6.91～7.00（m,2H）,6.64(d,J=12.0 Hz,1H),5.93(d,J=9.0 Hz,1H),4.40(d,J=6.0 Hz,2H)；ESI-MS (m/z):242.9 (M+H+)。

2.3 (1R,3S,5R)-2-叔丁氧基-3-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)-5-(4-((4-氟苄基)氨基)-1H-吲唑-1-基)环戊-1-醇 (9)的合成

将0.33 g (2 mmol)N-(4-氟苄基)-1H-吲咗-4-胺7和0.53 g (2 mmol) 18-冠-6加入到无水THF(30 ml)中，氮气保护下，缓慢加入0.08 g (2 mmol)60%钠氢，室温搅拌5 min，然后，升温至80 ℃，搅拌20 min后加入(3aS, 5S, 6aS)-4-叔丁氧基-5-((叔丁基二苯基硅基氧基)甲基)四氢-4H-环戊-[d][1,3,2]-二氧硫杂-2,2-二氧化物 8 (2 mmol)，继续反应8 h，冷却至0 ℃，用20%硫酸调pH为3，在50 ℃下搅拌30 min。用10%氢氧化钠水溶液调pH为中性后，二氯甲烷萃取(10 ml×3)，合并有机层，干燥，蒸去溶剂后柱色谱纯化得到534 mg蓝色油状物9，收率53.3%。1H NMR (300 MHz,DMSO-d6)δ: 7.96 (s, 1 H), 7.84 - 7.74 (m, 4 H), 7.46 -7.41 (m, 9 H), 7.37 (q,J= 5.4, 8.8 Hz, 1 H), 7.25 (q,J= 7.6, 8.3 Hz, 1 H), 6.94 (d,J= 8.4 Hz, 1 H),6.25(d,J=7.6 Hz, 1 H), 4.93 - 4.89(m, 1 H), 4.69 (s,1 H), 4.52 (s, 2 H), 4.47 (d,J= 5.7, 8.0 Hz, 1 H), 4.15(brs, 1 H), 3.82 (ddd,J= 7.0, 10.4, 17.0 Hz, 2 H),3.58 (d,J= 5.3 Hz, 1 H), 2.71 - 2.64 (m, 1 H), 2.58 -2.51 (m, 1 H), 2.40 - 2.34 (m, 1 H), 1.22 (s, 9 H),1.15 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z): 666.3 (M+H+)。

2.4 硫代碳酸苯基(1R,3S,5R)-2-叔丁氧基-3-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)-5-(4-((4-氟苄基)氨基)-1H-吲唑-1-基)环戊酯(10)的合成

向0.8 g (1.2 mmol)化合物9的二氯甲烷(20 ml) 溶液中加入N,N-二甲氨基吡啶0.44 g (3.6 mmol) 和硫代氯甲酸苯酯0.41 g (2.4 mmol)，室温反应12 h，用甲醇 (1 ml) 淬灭，饱和食盐水洗涤，干燥，蒸去溶剂，柱色谱分离得211 mg 黄色油状物10，收 率21.9%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ:8.05 (s, 1 H), 7.76 - 7.72 (m, 4 H), 7.51 - 7.42 (m, 8 H), 7.35 (t,J= 7.6 Hz, 2 H), 7.26 (t,J= 7.6 Hz, 2 H),7.13 - 7.08 (m, 2 H), 6.94 - 6.89 (m, 3 H), 6.26 (d,J=7.6 Hz, 1 H), 6.09 (q,J= 3.8 Hz, 1 H), 5.37 - 5.30(m, 2 H), 4.61 (t,J= 4.0 Hz, 1 H), 4.53 (s, 2 H), 3.82(dq,J= 7.0, 10.1, 17.2 Hz, 2 H), 2.81 - 2.72 (m, 1 H),2.35 - 2.23 (m, 2 H), 1.26 (s, 9 H), 1.12 (s, 9 H)； ESIMS(m/z): 802.3 (M+H+)。

2.5 1-((1R,4S)-3-叔丁氧基-4-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)环戊基)-N-(4-氟苄基)-1H-吲唑-4-胺 (11)的合成

向0.56 g (0.7 mmol) 化合物10的无水甲苯(20 ml) 溶液中加入三正丁基氢化锡1.05 g (3.6 mmol) 和偶氮二异丁腈0.39 g (2.4 mmol)，110 ℃反应1.5 h，蒸去溶剂，柱色谱分离得141 mg 黄色油状物11，收率31.0%。1H NMR (300 MHz,CDCl3)δ: 7.97 (s, 1 H), 7.78 - 7.68 (m, 4 H), 7.49 -7.35 (m, 8 H), 7.25 - 7.16 (m, 1 H), 7.06 (t,J= 8.8 Hz, 2 H), 6.96 - 6.84 (m, 1 H), 6.80 (d,J= 8.4 Hz, 1 H), 6.19 (d,J= 7.6 Hz, 1 H), 5.28 - 5.14 (m, 1 H),4.53 - 4.41 (m, 3 H), 3.83 (dq,J= 6.0, 10.0, 16.3 Hz,2 H), 2.64 - 2.50 (m, 1 H), 2.47 - 2.35 (m, 1 H), 2.35 -2.18 (m, 3 H), 1.18 (s, 9 H), 1.09 (s, 9 H)； ESI-MS(m/z): 650.3 (M+H+)。

2.6 ((1S,4R)-2-叔丁氧基-4-(4-((4-氟苄基)氨基)-1H-吲唑-1-基)环戊基)甲醇 (12) 的合成

将0.13 g (0.2 mmol) 化合物11溶于THF (3 ml) 和吡啶 (3 ml)混合溶剂中，冷却至室温，滴加0.21 g (2.1 mmol) 吡啶氢氟酸盐，滴完后室温反应1 h。饱和碳酸钠溶液调pH为中性，用乙酸乙酯和水分层，有机层用饱和食盐水洗涤，干燥，蒸去溶剂，柱色谱分离得81 mg 黄色油状物12，收率97.9%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.91 (s, 1 H),7.38 (dd,J= 5.4, 8.4 Hz, 2 H), 7.19 (t,J= 8.1 Hz, 1 H), 7.43 - 7.32 (m, 2 H), 6.82 (d,J= 8.4 Hz, 1 H),6.19 (d,J= 7.5 Hz, 1 H), 5.22 - 5.10 (m, 1 H), 4.62(q,J= 6.4 Hz, 1 H), 4.47 (s, 2 H), 3.89 (dd,J= 2.6,11.4 Hz, 1 H), 3.72 (dd,J= 5.6, 11.4 Hz, 1 H), 3.48(br s, 1 H), 2.60 - 2.47 (m, 2 H), 2.47 - 2.34 (m, 1 H),2.30 - 2.08 (m, 2 H), 1.26 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z):412.2 (M+H+)。

2.7 ((1S,4R)-2-叔丁氧基-4-(4-((4-氟苄基)氨磺酰胺)-1H-吲唑-1-基)环戊基)甲基 磺酰胺 (13) 的合成

将82 mg (0.2 mmol) 化合物12和0.14 ml (1.0 mmol) 三乙胺加入到乙腈(5 ml)中，冷却至0 ℃，加入2.0 mol/L氯磺酰胺乙腈溶液 (0.6 mmol)，室温反应70 min。用甲醇 (2 ml) 淬灭，蒸去溶剂，柱色谱分离得45 mg 棕色油状物13，收率40.7%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.99 (s, 1 H), 7.32 (d,J=8.1 Hz, 1 H), 7.25 - 7.11 (m, 3 H), 7.04 (d,J= 7.0 Hz, 1 H), 6.85 (t,J= 8.8 Hz, 2 H), 5.24 (s, 2 H), 5.07(s, 1 H), 4.84 (s, 2 H), 4.43 - 4.30 (m, 2 H), 4.28 -4.16 (m, 1 H), 2.80 - 2.65 (m, 1 H), 2.43 - 2.30 (m, 1 H), 2.27 - 2.16 (m, 1 H), 2.16 - 2.03 (m, 2 H), 1.86(s, 2 H), 1.19 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z): 570.2(M+H+)。

2.8 ((1S,4R)-4-(4-((4-氟苄基)(氨磺酰胺)-1H-吲唑-1-基)-2-羟基环戊基)甲基磺酰胺 (14) 的合成

将57 mg (0.1 mmol) 化合物13溶于70%三氟乙酸溶液，室温反应1.5 h，用甲醇 (5 ml) 淬灭，蒸去溶剂，柱色谱分离得25 mg 深蓝色油状物14，收率62.1%。1H NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.05 (s, 1 H), 7.51 (d,J= 8.5 Hz, 1 H), 7.37 (dd,J= 7.3, 8.4 Hz, 1 H), 7.30 - 7.27 (m, 2 H), 7.20 (d,J= 7.3 Hz, 1 H), 6.93 - 6.89 (m, 2 H), 5.45 - 5.37 (m, 1 H), 4.54(t,J= 4.0 Hz, 1 H), 4.39 (dd,J= 7.6, 9.8 Hz, 1 H),4.23 (dd,J= 7.2, 9.8 Hz, 1 H), 2.86 - 2.76 (m, 1 H),2.48 - 2.40 (m, 1 H), 2.32 (ddd,J= 1.6, 7.8, 9.7 Hz, 1 H), 2.25 - 2.11 (m, 2 H), 2.10 - 2.04 (m, 1 H), 1.68 -1.59 (m, 1 H)； ESI-MS (m/z): 514.1 (M+H+)。

2.9 体外抗肿瘤活性测试[9]

选用人肺腺癌细胞H1299、人肠癌细胞HCT116、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞PANC-1、人骨肉瘤细胞Saos-2 及U-2 OS，均由上海医药工业研究院药理室冻存和传代。样品用DMSO（Merck）溶解后，加入PBS配成1 000 μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS稀释。向96孔板每孔加入浓度为（5～6）×104个/ml的细胞悬液100 μl，置37 ℃，5% CO2培养箱内。24 h后，加入样品液，每孔10 μl，设双复孔，37 ℃，5% CO2作用72 h。每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，作用4 h后加入溶解液，每孔100 μl，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570 nmOD值。

2.10 蛋白质免疫印迹实验[10]

选用12孔4%～12% Bis/Tris SDS-PAGE胶，每孔上样40 μg提取蛋白。第一泳道加6 μl marker，上样蛋白按浓度从高到低或从低到高排列加样。用MES SDS电泳液在80 V条件下作用30 min，调节电压至150 V跑胶约1 h。在NuPAGE转膜液中，在50 V电压下转膜2 h。然后室温封闭2 h，洗膜3次，每次15 min。在4℃条件下孵育一抗，过夜。洗膜3次，避光抚育二抗50 min，洗膜3次，用LI-COR扫膜仪扫膜。

2.11 细胞凋亡试验

向6孔板中分别加入HCT116和PANC-1细胞(5×105个/ml)和10 μmol/L的化合物14后，分别孵育12、24和48 h，胰蛋白酶消化后用PBS冷溶液洗涤2次。离心去除上清液后，将细胞悬浮于400 μl缓冲液，加入5 μl的annexin V-FITC，室温孵育15 min。然后加入10 μl的碘化丙啶，室温避光继续孵育15 min，收集细胞，用流式细胞仪(BD Accuri C6)检测。

2.12 细胞周期试验

向HCT116和PANC-1细胞中加入10 μmol/L的化合物14后，分别孵育12、24和48 h。收集细胞，PBS溶液洗涤2次，用75%乙醇固定过夜。PBS溶液洗涤后，悬浮于100 μl PBS溶液，加入200 mg/ml Rnase，反应30 min消除RNA干扰。然后，加入20 μg/ml的碘化丙啶，孵育30 min，洗涤，用流式细胞仪检测。

3 结果与讨论

3.1 化学合成

目标化合物的合成经过23步反应得到，合成路线见图2。以2-甲基-3-硝基苯胺4为原料，环合生成4-硝基吲唑5。经10% Pt/C催化还原硝基生成4-氨基吲唑6后，与4-氟苯甲醛在甲醇中室温反应，硼氢化钠还原后得到关键中间体7。参考文献以D-核糖为原料，经12步反应，以16.0%的总收率获得另一个关键中间体8[11]。在18-冠-6催化下，化合物7与中间体8反应后，水解生成化合物9，收率为53.3%。将化合物9与硫代氯甲酸苯酯反应后，在AIBN催化下用n-Bu3SnH还原成胺11。然后，用吡啶氟化氢盐脱去TBDPS保护，得到5'-羟基化合物12。最后，与氯磺酰胺反应生成5'-氯磺酰胺13，脱去叔丁氧基保护得到目标化合物14，反应总收率为0.1%。

表1 双磺酰胺吲唑14的体外抗增殖活性

3.2 体外抗肿瘤活性研究

课题组选择 (H1299、HCT116、MDA-MB-231、HepG2、PANC-1、Saos-2和U2 OS)7种肿瘤细胞株，以多柔比星为阳性对照，采用MTT法开展了体外抗肿瘤活性研究，结果见表1。相对阳性对照药多柔比星，化合物14对所有肿瘤细胞株均表现出中等程度的活性，但也显示出一定的选择性。对H1299、HCT116、PANC-1、Saos-2和U2 OS活性优于其他2种肿瘤细胞株，如对Saos-2细胞株的IC50达3.45 μmol/L，相比MDA-MA-231细胞株提高23倍，以上结果初步说明化合物14具有一定的广谱抗肿瘤活性。

3.3 NAE抑制活性研究

为考察化合物14对HCT116肿瘤细胞的NAE抑制活性，课题组进行免疫蛋白印迹实验，结果见图3A。不同浓度化合物14作用24 h后，UBC12-NEDD8水平得到明显抑制，并且呈剂量依赖性导致UBC12蛋白的累积，与阳性对照药MLN4924的作用一致(图3B)。结果表明，化合物14能有效抑制NAE活性。

3.4 细胞凋亡诱导作用和细胞周期阻滞研究

为进一步研究化合物14的抗肿瘤机制，课题组选择较为敏感的2种肿瘤细胞株PANC-1 和HCT116进行了细胞凋亡和细胞周期阻滞研究。10 μmol/L化合物14作用48 h后，在PANC-1细胞株中显示出明显的细胞凋亡作用(图4A)。相比空白组的1.80%，凋亡细胞率上升至23.83%，并且呈时间依赖性。化合物14作用12 h后，能明显导致G2期细胞阻滞(图4B)。初步表明化合物14通过细胞凋亡和细胞周期阻滞作用抑制PANC-1细胞增殖作用。但是，对HCT116细胞株，化合物14作用48 h后能明显导致细胞凋亡，但对细胞周期影响较小(图5A、图5B)。

4 结论

采用骨架跃迁的药物设计策略，以吲唑骨架代替MLN4924的吡咯并嘧啶骨架，得到一类非核苷的NAE抑制剂，显示出广谱的抗肿瘤活性。机制研究表明，双磺酰胺类化合物14能显著诱导PANC-1细胞的凋亡作用，导致细胞周期阻滞，是值得进一步研究的NAE抑制剂先导化合物。