张 晶，顾永卫，武 鑫，（. 内蒙古医科大学附属医院药剂部，内蒙古 呼和浩特 00050；. 上海维洱实验室，上海07）

前列腺癌（PCa）已成为威胁男性健康的主要肿瘤之一[1]。大多数早期患者为雄激素依赖型（androgen-dependent prostate cancer, ADPC），在经过抗雄激素治疗1～1.5年后，ADPC转为雄激素非依赖型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）的概率较大，患者经去势治疗后，病情会继续恶化，甚至死亡[2-3]。因此，前列腺癌的治疗方案需根据其ADPC和AIPC不同特性给予合理的治疗，但在治疗过程中难以对病程进阶的过渡进行准确诊断，故而影响治疗效果。研究一种可同时治疗ADPC和AIPC的给药系统是近年来研究的热点[4]。本实验在前期研究ADPC给药基础上[5]，选择可同时靶向ADPC/AIPC型的2种前列腺癌细胞(LNCaP，PC3)表面CD71受体的第三代适配体C2min为靶头[6]，并利用双功能聚乙二醇（NHSPEG-MAL）将其与阳离子聚合物聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）相连，装载对2种癌细胞均具有抑制作用的基因药物（siR-M），构建双重靶向的纳米基因给药系统（PAMAM-PEGC2min/siR-M），并对其理化性质、体外摄取、转染性质以及体内分布进行考察。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

Mercury Plus 300 MHz超导核磁共振波谱仪（Varian公司，美国）；IX2-RFACA倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）；C2min巯基化适体，（Ribo Bio，广州）；pEGFP-N2-Luc绿色荧光蛋白和虫荧光素酶表达质粒pDNA（siR-m, Weijin Bio，中国）；化学发光检测仪（Promega公司，美国）；QIAGEN Plasmid Mega Kit（Qiagen GmbH, 德国）；PAMAM (G5)溶液（5%，体积分数），Sulfhydryl Addition Kit，DyLight-633 NHS Ester，BCA Protein Assay kit（Thermo，美国）；双功能聚乙二醇MAL-PEG-NHS，相对分子质量4000（Nektar，美国）；FAM、cy-7、RPMI-1640培养基、胰酶（Gibco, 美国）；其他试剂均为分析纯。

1.2 细胞和实验动物

ADPC细胞系LNCaP和AIPC细胞系PC3（中国科学院上海生命科学研究院）；BALB/C裸鼠，雄性（上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（苏）2018-0006）。

1.3 细胞培养及荷2种移植瘤裸鼠模型的建立

LNCaP和PC3培养的培养基：含5%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640；培养条件：37 ℃、5%CO2[7]。每隔2～3 d更换培养液，并在细胞长至80%融合状态时用于实验。

将对数生长期的PC3和LNCaP细胞消化并稀释成细胞悬液，浓度为：1×107个细胞/ml，将上述细胞悬液分别接种于裸鼠背部的两侧（0.2 ml/只）。接种15～20 d后，选择肿瘤外观圆润、体积长至500 mm2左右的荷瘤裸鼠作为实验模型。

1.4 PAMAM-PEG-C2min的合成与结构鉴定

在定性实验中，采用FAM-NSH示踪PAMAM。FAM-PAMAM-PEG-C2min的制备：精密量取PAMAM (G5)甲醇溶液和FAM储备液（摩尔比5:1），前者用氮气吹干，4 ℃条件下，于暗处反应12 h，得到的产物通过G-25尺寸排阻色谱以除去游离的FAM，得FAM-PAMAM。再与PEG（NHS-PEGMAL）溶液混合（PEG和PAMAM的摩尔比为2 :1），在避光、室温条件下反应15 min，利用超滤管（分子量截留为5000）对产物进行超滤纯化，得FAMPAMAM-PEG。取C2min溶液和FAM-PAMAMPEG溶液（C2min和PAMAM摩尔比为1:1），室温避光反应24 h，得FAM-PAMAM-PEG-C2min。cy7标记和非标记的PAMAM、PAMAM-PEG、PAMAM-PEG-C2min载体制备同前所述。并采用1H NMR对上述3种非FAM标记的载体进行结构分析。

1.5 两种前列腺癌细胞对PAMAM-PEG-C2min的摄取

将PC3和LNCaP细胞接种于6孔培养板中（6×104/孔），当细胞汇合度为80%时，更换为无血清培养液，并分别加入系列浓度为0.04、0.20、0.40、0.80和1.20 μmol/L的FAM-PAMAM-PEGC2min，与PC3和LNCaP共孵育1 h。PBS洗3次后，通过倒置荧光显微镜拍照观察2种细胞对纳米复合物的摄取情况。随后将细胞消化并重悬于预冷的PBS中，通过流式细胞仪对2种前列腺癌细胞中FAM的阳性率进行定量检测。

1.6 PAMAM-PEG-C2min/pDNA纳米复合物的制备及表征

PAMAM、PAMAM-PEG和PAMAM-PEGC2min分别与质粒溶液（12 μg/ml）按照PAMAM与DNA的N/P比1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1漩涡混合30 s，即制得PAMAMpDNA、PAMAMPEGpDNA和PAMAM-PEG-C2minpDNA复合物。利用激光粒度分析仪Z90（Malvern，英国）测定不同N/P比PAMAM-PEGpDNA的粒径和Zeta电位（n=3）。

1.7 PAMAM-PEG-C2min/pDNA体外转染

PC3和LNCaP细胞接种于24孔培养板中（2×104/孔），细胞融合后更换无血清培养基，并加入“1.6”项下制备的不同N/P比的纳米复合物（浓度：3 μg pDNA质粒/孔），37 ℃、5% CO2条件孵育2 h后用完全培养基孵育48 h，采用倒置荧光显微镜（激发波长488 nm，发射波长525 nm）拍照观察报告基因绿色荧光蛋白的表达。随后加入细胞裂解液对细胞裂解，并采用荧光素酶分析系统检测细胞上清液中的基因表达产物荧光素酶的活性[8]。

1.8 纳米复合物的体内靶向性效果

取荷瘤裸鼠，尾静脉注射cy7-PAMAM-PEGC2min（制备方法同“1.4”项），分别于给药0.5、2、6、12、24 h时，利用动物活体成像仪观察纳米复合物在体内的分布情况。

1.9 统计学处理

采用SPSS 18分析软件进行独立样本t检验和描述性统计分析，数据以（x±s）表示。

2 结果

2.1 PAMAM-PEG-C2min的结构鉴定

双功能NHS-PEG-MAL中NHS可与PAMAM表面带有正电的氨基反应，生成PAMAM-PEG（PAMAM-PEG-MAL），PEG另一端的MAL可与C2min中的巯基反应，形成PAMAMA-PEG-C2min。1H NMR结果中D2O溶剂峰为4.7 ppm，PAMAM载体的特征峰在2.2～3.4 ppm（图1A）；PEG带有的亚甲基吸收峰出现在3.6 ppm，马来酰亚胺的特征峰出现在8.3 ppm（图1B），通过比较特征峰的峰面积，得出PEG的修饰率为2.4。C2min中各氨基氢的峰与PAMAM的特征峰重叠，表现为2.2～3.4 ppm的混合峰（图1C），同时8.3 ppm处特征峰消失，表明C2min成功连接到PAMAM-PEG上，PAMAM-PEG-C2min合成成功。

2.2 两种前列腺癌细胞对PAMAM-PEG-C2min的摄取

随着PAMAM-PEG-C2min浓度升高，PC3和LNCaP中的荧光强度逐渐增强，说明LNCaP细胞和PC3细胞对纳米复合物的摄取效率体现出浓度依赖性（图2A）。定量检测结果表明，PAMAM-PEGC2min浓 度 从0.04 μmol/L增 加 到0.12 μmol/L，LNCaP细胞阳性率从（10.31±0.38）%增加到（82.34±3.83）%，PC3细胞阳性率从（8.75±0.47）%增加到（85.37±3.25）%。且相同浓度下，LNCaP细胞和PC3细胞对纳米复合物的摄取无明显差异，与荧光显微镜定性结果一致(图2B)。

2.3 不同N/P比PAMAM-PEG-C2min/pDNA纳米复合物粒径和Zeta电位

如图3所示，PAMAM-PEG-C2min/pDNA基因递送系统中N/P的增加，纳米复合物粒径逐渐降低，Zeta电位逐渐增加。产生这一结果的原因是：阳离子PAMAM载体比例增大，纳米复合物的电荷变大，其对基因的包载能力增强，包裹更加紧密。

2.4 PAMAM-PEG-C2min/pDNA体外转染

PAMAM-PEG-C2min/pDNA体外转染结果表明，报告基因在细胞内的表达效率与N/P成正比。荧光显微镜（图4A）和生物发光检测仪（图4B）的检测结果表明，随着N/P比的增加，纳米复合物的转染能力增强。此外，PAMAM-PEG经C2min修饰后，对2种细胞的转染效率均显著增强，表明PAMAM-PEG-C2min纳米复合物可有效地靶向2种不同类型的前列腺癌细胞。

2.5 纳米复合物的体内靶向性效果

荷瘤裸鼠体内荧光分布如图5所示，Cy7-PAMAM-PEG-C2min经尾静脉注射0.5 h后，通过血液循环分布于全身；2 h后，在肿瘤部位聚集，体现出肿瘤靶向性；12 h后荧光强度降低；24 h后，荧光基本消失。结果显示，C2min修饰的纳米载体给药后，肿瘤部位的荧光强度均高于其他部位，对实体瘤具有显著的特异靶向性，实现可同时靶向ADPC和AIPC组织的作用。

3 讨论

PAMAM是一种阳离子型聚合物，被广泛应用于基因载体的研究，具有粒径易控、表面可修饰等特点[9]。寡核苷酸适配体简称适体，是一种能与多种靶分子特异性结合的单链或双链寡核苷酸，具有广泛的受体范围[10-12]。且适体制备方便，有较高的稳定性，在生产、储存和运输中有很大的优势[6,13]。LNCaP和PC3表面均高表达CD71受体，且第三代新型适体C2min，可以与CD71很好的结合[14]。C2min具有43个核苷酸长度(43 nt)，体内外稳定性良好。因此，以C2min适体作为靶头，可实现对2种前列腺癌细胞的双重靶向。

核磁共振谱图结果表明，本研究成功合成了PAMAM-PEG-C2min，体外摄取实验证明，经C2min修饰的纳米复合物可显著增加PC3和LNCaP的摄取能力。随着PAMAM-PEG-C2min-pDNA中N/P比的增加，电荷逐渐增大，粒径逐渐减小，表明纳米复合物对质粒的包载更加紧密，且纳米复合物的粒径和电位是影响其摄取和转染效率的主要因素[15]，体外转染实验结果表明，随着N/P比的增加，纳米复合物在2种前列腺癌细胞中转染效率有显著性提高。且经C2min修饰后，表现出良好的体外靶向能力。动物活体成像结果表明，PAMAMPEG-C2min可同时靶向2种前列腺癌组织，是一种良好的药物靶向递送载体，为前列腺癌不同发展阶段的综合治疗和靶向治疗提供了新的技术平台。