武卫党，郭继文，张丹凤，耿蓬勃，路 艳，石 磊

西电集团医院(西安 710077)

心肌缺血再灌注损伤是临床常见疾病，多发与急性心肌梗死的冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention，PCI)等，往往导致心肌梗死患者的术后治疗及恢复，是目前临床亟待解决的问题[1]。缺血再灌注损伤的作用机制复杂，目前主要的作用机制包括，中性粒细胞浸润、钙超载、能量代谢障碍等多种学说。线粒体是细胞能量供应的关键，心肌细胞线粒体损伤可以导致心肌能量代谢障碍的发生，导致ATP功能减少，而能量代谢可以进一步加剧细胞损伤的发生[2-3]。

五味子乙素是五味子果实中含量最丰富、生物活性最高的一种二苄基环辛二烯衍生物。是治疗病毒性和化学性肝炎的常用中药[4]。现代药理研究已证明其具有抗氧化、抗炎、心脏保护、肝保护、神经保护和肾保护作用[5]。近年的研究发现五味子乙素在心脏相关疾病中具有一定的保护作用，目前研究发现包括其在心肌梗死、阿霉素诱导的心肌细胞凋亡具有显著的改善作用，同时对糖尿病血流变也具有改善作用[6-7]。糖酵解是机体在无氧条件下，维持细胞能量代谢的补充手段之一，研究发现促进糖酵解反应可以显著改善缺血再灌注导致的心肌损伤的发生[8]。而目前围绕五味子乙素在缺血再灌注损伤中能量代谢障碍的调节作用及其对糖酵解反应的影响作用，尚未见报道。因此本研究将采用离体心脏缺血再灌注模型，考察五味子乙素对离体心脏血液流变学，氧化应激及能量代谢的影响作用。

材料与方法

1 材 料 健康雄性SD大鼠30只，体重180～220 g，10～15周龄，购自于西安医学院实验动物中心提供。正常条件下，自由饮食，饮水适应性饲养7 d用于实验。

2 试剂及设备 五味子乙素(sigma， A4589)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(建成生物医学工程研究所，中国)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)，Caspsase-9(碧云天生物技术公司，中国)；ATP含量，乳酸(Bivision公司，美国)；离体工作心灌流装置(美国RADONTI公司)，生物机能检测系统(Powerlab system，AD Instrument Ltd.澳大利亚)，酶标仪(BioTek公司，美国)。

3 模型制备 采用Langendorff离体心脏灌流技术建立大鼠离体心肌缺血再灌注模型，模型建立方法，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠。大鼠心脏置于4 ℃的生理盐水中，Langendorff灌流装置上安装大鼠心脏，逆行恒压灌注，剪开右心房，使冠脉流出液自然流出。采用95% O2+5%CO2混合气饱和的K-H 缓冲液(pH 值7.35～7.40) 在恒温(37 ℃) 、恒压(100 cm H2O) 条件下灌注。将连接有测压导管的心室球囊送入左心室，采用多导生理记录仪检测相关指标。灌注液及心脏周围温度用恒温循环水浴维持在37 ℃。平衡灌注30 min，待心脏各项功能稳定，关闭灌流液停止灌流，造成全心缺血，31 min 后打开灌流液再复灌30 min[10]。

4 血流动力学监测 采用生物机能检测系统，检测离体心肌左室发展压(LVDP)、左室内压上升/ 下降速率(±dp/dt)和心率(HR)，考察五味子乙素对其的影响。

5 心肌组织中SOD、GSH-Px活性、MDA含量检测 采用SOD、GSH-Px、MDA试剂盒，检测心肌组织中SOD、GSH-Px活性、MDA 含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。

6 心肌组织中Caspase-3、Caspase-9活性含量检测 采用Caspase-3、Caspase-9试剂盒，检测心肌组织中Caspase-3、Caspase-9活性，实验步骤按照试剂盒说明书进行。

7 心肌组织中ATP、乳酸含量检测 采用ATP、乳酸试剂盒，检测心肌组织中ATP、乳酸含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。

8 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件分析，实验数据采用均值±标准差表示，组间多组数据比较采用单因素方差分析，组内数据比较采用LSD-t 检验。

结 果

1 五味子乙素对心肌血流动力学左室发展压(LVDP)、心率(HR)、左室内压上升/ 下降速率(±dp/dt)max的影响 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的影响，实验结果模型大鼠心脏LVDP、HR、(±dp/dt)max与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。给予五味子乙素干预后，给药组大鼠心肌组织相关血流变指标LVDP、HR、(±dp/dt)max与模型组比较均有显著差异，给予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制剂后，心肌相关LVDP、HR、 (±dp/dt)max与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，但继续给予五味子乙素干预后，对心肌血流变没有显著改善作用，与抑制剂组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 五味子乙素对心肌血流动力学LVDP、HR、(±dp/dt)max的影响

注：与空白组比较，*P< 0.01 ；与模型组比较，△P<0.05

2 五味子乙素对心肌组织中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影响 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的对心肌组织氧化应激反应的影响，实验结果模型大鼠心脏SOD、MDA、 GSH-Px含量与空白组比较具有显著差异，SOD及 GSH-Px显著降低，而 MDA含量显著升高(P<0.05)。给予五味子乙素干预后，给药组大鼠心肌组织相关SOD、MDA、 GSH-Px含量与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，可显著恢复抗氧化酶SOD及 GSH-Px，抑制MDA的升高。给予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制剂后，心肌相关氧化应激反应指标与空白组比较具有显著差异，联合给予五味子乙素干预后，五味子乙素对心肌氧化应激指标没有显著改善作用，与单一抑制剂组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 五味子乙素对心肌组织中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.01 ；与模型组比较，△P<0.05

3 五味子乙素对心肌组织中Caspase-3活性、ATP、乳酸含量的影响 实验结果模型大鼠心脏ATP，与空白组比较显著降低，乳酸含量显著升高且均具有显著差异，此外线粒体相关指标Caspase-3活性显著升高(P<0.05)。给予五味子乙素干预后，给药组大鼠心肌组织相关ATP含量显著恢复，乳酸含量进一步升高且与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，同时可明显抑制线粒体损伤相关指标Caspase-3的活性。给予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制剂后，心肌相关线粒体损伤指标及能量代谢指标与空白组比较均具有统计学差异，而联合给予五味子乙素干预后，五味子乙素对心肌Caspase-3活性，ATP，乳酸含量均没有显著改善作用，与单一抑制剂组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 五味子乙素对心肌组织中Caspase-3，Caspase-9活性、ATP、乳酸含量的影响(μg/mg)

注：与空白组比较，*P<0.01 ；与模型组比较，△P<0.05

讨 论

缺血再灌注损伤(I/R)是心脏手术和器官移植的重要组成部分，是发病率和病死率的主要决定因素。I/R后的心脏保护仍然亟待解决的问题。在生理条件下，充足的氧气供应是维持心脏活力和功能必不可少的。在缺血相关缺氧期间，由于缺氧和营养供应不足，心肌内发生了一系列突然的生化和代谢变化。低氧停止氧化磷酸化，导致线粒体功能障碍、ATP消耗和心肌收缩功能抑制，导致心肌血流变发现显著改变。糖酵解是在厌氧或有氧条件下将葡萄糖转化为乳酸或丙酮酸盐的生化过程，其净产量为2摩尔的ATP。在缺血期间，糖酵解因其产生ATP的能力而成为一种非常重要的能量来源[9-10]。

五味子乙素是从五味子果实中分离出的活性单体，其在临床上被应用于治疗肝炎和缺血性疾病，如心肌缺血和脑缺血。近年来的研究进一步表明，五味子乙素可通过下调炎症细胞因子、激活eNOS通路、抑制细胞凋亡、抑制心肌缺血再灌注等途径，改善心肌功能，减轻心肌重塑[11-12]。此外研究表明五味子乙素对心肌缺血/再灌注(I/R)损伤具有一定保护作用，并且在体内和体外模型中具有很强的抗炎性能。研究还表明，在体外模型中，五味子乙素可以通过ATR抑制特异性地抑制p53的磷酸化[13-14]。但五味子乙素对缺血再灌注心肌损伤的能量代谢调节作用尚未见报道，因此在本研究中我们采用离体心肌缺血再灌注模型考察五味子乙素对其的影响，研究结果表明，五味子乙素可以显著改善心肌血流变相关指标，显著升高左室发展压、左室内压上升/ 下降速率和恢复心肌心率。同时通过检测氧化应激指标及线粒体线粒体相关指标，结果表明五味子乙素可以显著抑制心肌氧化应激反应的发生，同时减少心肌线粒体损伤的发生，通过检测心肌ATP及乳酸生成含量表明，五味子乙素可以显著升高心肌ATP及乳酸含量，恢复心肌能量代谢。当将五味子乙素与糖酵解抑制剂Lonidamine联合使用后，五味子乙素对心肌的改善作用显著降低，且对心肌能量代谢的调节作用显著降低。心肌缺血再灌注损伤发生机制复杂，糖酵解是在机体无氧环境下是机体功能的关键环节[15]，五味子乙素可通过调节心肌糖酵解反应，改善缺血再灌注损伤是发生，但其调节心肌糖酵解反应的机制还有待探究。