陆 游，南文龙，陈义平，彭大新

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

牛结节性皮肤病（lumpy skin desease，LSD）是一种由痘病毒科（Poxviridae）、脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）、羊痘病毒属（Capripoxvirus）的牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的急性、亚急性传染病[1-2]。LSDV 为双链DNA 病毒[3]，只有1 个血清型[4]，与同为羊痘病毒属的山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）和绵羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）具有共同的主要抗原[5-6]。电镜下同属的3种病毒在形态上无显著差异[7]。1929年，LSD 首次在非洲的赞比亚地区被发现，此后逐渐向北扩散，主要在撒哈拉以南地区流行[8]。1989年后，LSD传入部分亚欧国家。2013—2019年，LSD 扩散至塞尔维亚、阿尔巴尼亚和俄罗斯等国家，逐步靠近我国[9-11]。2019年8月，我国在新疆伊犁地区首次确诊该病。LSD 可导致养牛业经济损失并影响国际贸易，是世界动物卫生组织（OIE）动物疫病名录中须通报的动物疫病[12]。依据我国动物防疫法规定，农业农村部暂对其按二类动物疫病管理并采取相应防控措施[13]。LSD 可通过明显的临床症状诊断，其实验室诊断主要依靠分子生物学与免疫学检测方法[12-15]。本文简要介绍LSD 的诊断方法研究进展，以期为我国LSD 防控提供技术支持。

1 临床检查

LSD 具有特征性的临床症状，包括：体温升高达40～41 ℃，肩胛下和股前的浅层淋巴结肿大，皮肤上出现直径10～50 mm 的结节，可视黏膜坏死，内有透明浆液或脓液渗出；公牛永久或暂时不育，母牛产奶量大幅下降[5-6]。

实验条件下，LSD 的潜伏期为4～19 d。当处于潜伏期或前驱期时，患病牛产生的皮肤病变需要与皮肤癣病、牛皮癣、光敏症、放线菌病、放线杆菌病、荨麻疹、昆虫叮咬、贝氏丝虫病、诺卡氏菌病、蠕形螨病、盘尾蚴病、盘尾丝虫病、荨麻疹、皮肤结核、伪疙瘩皮肤病和牛痘鉴别[4-5，12]。此后，患病牛呈现黏膜坏死、破溃，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、恶性卡他热、牛疱疹性乳腺炎、牛传染性鼻气管炎和牛流行性口炎等进行鉴别[4-5，13]。此外，LSD 还存在无临床症状的隐性感染现象，需要进一步的实验室检测。

2 分子生物学检测方法

分子生物学方法常用于LSDV 检测。适合检测的样品有，牛精液、血清或EDTA 抗凝全血、鼻咽黏膜分泌物拭子、破溃皮肤结节内黏液或脓液，以及研磨后的皮肤活检组织、实质器官组织等[15]。主要检测方法有，常规聚合酶链式反应（PCR），实时荧光定量PCR（fluorescence quantification realtime PCR，rPCR），高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）曲线分析法，环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重组酶聚合酶扩增法（recombinase polymerase amplification，RPA）。

2.1 常规PCR

常规PCR 检测法通常可在出现症状后的7～19 d[2]检出样品中的LSDV 核酸阳性，最长可达161 d。1986年，Kitching 等[16]采集了过去30年在撒哈拉以南流行的12 株羊痘病毒属病毒，包含7 株SPPV、4 株GTPV、1 株LSDV，通过限制酶Hind III 消化后，电泳显示3 种病毒核酸产生了33种不同长度的条带，其中有31 种长度相似而稳定，表明该属病毒关系紧密。根据相关基因设计PCR引物，可实现LSDV 及同属GTPV、SPPV 的通用型检测。

Ireland 等[17]按照参考文献[18]，基于附着蛋白基因VP32建立了羊痘病毒属PCR 通用检测方法，检测限为10-1TCID50，检测羊痘病毒属的细胞培养和临床皮肤活检样品23 份，结果均为阳性（阳性率100%），其中LSDV 样品9 份、SPPV 样品10 份、GTPV 样品4 份。该方法具有较好的属特异性，与牛痘病毒、羊口疮病毒、疱疹病毒以及未感染的对照样品均不发生反应。

Lamien 等[19]设计了1 对跨越SPPV RPO30 蛋白基因21 bp 缺失区域的引物，检测LSDV 和GTPV阳性产物为172 bp，SPPV 阳性产物为151 bp，3 种病毒检测限均为250 copies/μL，且与羊口疮病毒、牛丘疹性口炎病毒、猪痘病毒和鹿痘病毒样品均无交叉反应，特异性良好。对46 株羊痘病毒属分离株的RPO30 位点进行克隆并测序，绘制系统进化树，结果与羊痘病毒属G 蛋白偶联趋化因子受体（GPCR）基因的绘制结果吻合。

2.2 实时荧光定量PCR

与常规PCR 相比，实时荧光定量PCR（qPCR）检测更加敏感、快速，可在病程更早期检出低拷贝数的核酸，可应用于羊痘病毒属通用检测、LSDV特异检测以及LSDV 野毒株与疫苗株的鉴别。

Das 等[20]优化了Bowden 等[21]和Balinsky等[22]建立的两种羊痘病毒属通用型rPCR 检测方法，添加了肉牛、绵羊、山羊的β-肌动蛋白基因（beta-actin gene，ACTB）的同源序列作对照，最低检测限均为10 copies/μL。检测人工感染SPPV的绵羊组织、感染GTPV 的山羊组织和感染LSDV的肉牛组织样品共50 份，改良前后Bowden 法检出的阳性样品数分别为29份（58%）和41份（82%），改良前后Balinsky 法检出的阳性数分别为41份（82%）和46 份（92%）。两种方法改良后特异性均为100%，牛疱疹病毒2 型、蓝舌病病毒、牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行性口炎病毒样品以及未感染病毒的对照样品检测结果均为阴性。

Alexander 等[23]基 于ORF044基因建立了特异性检测LSDV 的rPCR 方法，检测限为0.5 TCID50。运用该方法检出243 份血清、全血和组织样品阳性，与平行检测LSDV P32 蛋白基因的rPCR 方法结果完全一致。特异性实验时，与SPPV、GTPV、牛痘病毒、羊口疮病毒和小反刍兽疫病毒样品均不发生反应。

Eirini 等[24]基于GPCR 蛋白基因，建立了LSDV 双探针rPCR 方法，可鉴别LSDV，并能区分野毒株和疫苗株，检测限均为8 copies/μL。该方法较为敏感，检测LSDV 野毒株感染组织样品119份，结果均为阳性（100%）；检测LSDV 疫苗株感染组织样品44 份，检出阳性43 份（98.18%）；检测SPPV、GTPV、痘苗病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒和黏液瘤病毒对照样品共73 份，结果均为阴性。

2.3 高分辨率熔解曲线分析

高分辨率熔解（HRM）曲线分析法无需设计探针，利用DNA 扩增片段的解链温度（Tm）差异，即可在单一反应体系中实现单核苷酸多态性（SNP）位点突变的区分，适用于3种羊痘病毒属病毒的鉴别。

Tesfaye 等[25]根据B22R基因同源物序列Tm平均值差异，建立了羊痘病毒属通用HRM 方法。该方法对LSDV、SPPV 和GTPV 的检测限分别为17.80、16.27 和17.01 copies/μL；准确检出了羊痘病毒属病毒细胞培养及临床样品61 份，其中LSDV 样 品32 份、SPPV 样 品18 份、GTPV 样 品11 份，且特异性良好，与牛疱疹病毒、小反刍兽疫病毒、羊口疮病毒样品均不发生反应。

Yana 等[26]建立了区分LSDV 野毒株与疫苗株的HRM 法，检测限均为0.1 TCID50。取不同地区同一时间感染羊痘病毒属病毒的动物血液和皮肤组织等样品共32 份进行检测，结果均为阳性，包含LSDV 野毒株11 份、LSDV 疫苗株8 份、SPPV样品8 份、GTPV 样品5 份。此方法特异性良好，检测牛痘病毒和羊口疮病毒样品，均未见明显扩增曲线。

2.4 环介导等温扩增

环介导等温扩增法（LAMP）是一种可以在恒温（60～65 ℃）条件下进行的基因扩增方法，通过电泳条带分析产物，根据添加特定染料产生的颜色变化，即可目视判断检测结果，适合基层实验室的LSD 临场快速诊断。

Das 等[27]建立了VP39蛋白基因的羊痘病毒属通用型LAMP 检测方法，目视阳性反应呈天蓝色，电泳验证阳性产物为199 bp，检测限为6.3 TCID50。检测人工感染组及对照组实验动物的黏膜拭子171 份、EDTA 抗凝血液78 份、组织样品30 份，检出阳性拭子86 份（50.3%）、血液30 份（38.5%）、组织20 份（66.7%）；平行的rPCR 检出阳性拭子88 份（51.5%）、血液29 份（37.2%）、组织26份（86.7%）。与rPCR 相比，该方法总体敏感性为97.0%。特异性方面，对可能引起相似症状的牛瘟病毒、羊口疮病毒、牛丘疹性口炎病毒、伪牛痘病毒样品和未感染病毒的组织样品，均无阳性扩增，不产生明显颜色变化。

Mwanandota 等[28]基 于VP39基 因，建 立了特异性检测LSDV 的LAMP 方法，检测限为8 copies/μL。阳性反应可在紫外光下产生颜色变化，阳性产物为192 bp。VP39-LAMP 法检测皮肤活检组织样品19 份，检出阳性13 份（68.4%）；检测血液样品40 份，检出阳性10 份（25%）。但是同步进行的PCR 法检出组织阳性7 份（36.8%）、血液阳性仅1 份（2.5%），结果存在一定差异。特异性试验中，该LAMP 方法与GTPV、SPPV、羊口疮病毒的核酸均不发生反应。

2.5 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增法（RPA）是另一种适合临床应用的等温快速扩增方法，不需要模板的热变性，可在较低的恒温（45 ℃）下进行操作。Shalaby 等[29]建立了羊痘病毒属通用型RPA 方法，检测临床样品34 份，检出LSDV 阳性样品22 份、阴性样品12 份，与rPCR 检测结果（阳性22 份、阴性12 份）相比，阳性检出率和方法敏感性均为100%，检测限为179 copies/μL。该方法特异性良好，检测羊口疮病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛痘病毒、小反刍兽疫病毒以及蓝舌病病毒的核酸样品，结果均呈阴性。

3 免疫学检测方法

免疫学方法能定性、定量检测血清抗体或感染性抗原，是LSD 实验室诊断的重要依据，可取牛结节或活检样品研磨液、破溃结节内浆液、眼鼻分泌物、血清等进行检测[30]。OIE 推荐应用病毒中和试验（virus neutralization test，VNT）[5]检测LSDV 特异性血清抗体。该方法也适用于LSD 群流行病学调查和疫苗免疫保护效果评价等。此外，已有商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒用于羊痘病毒属的检测，但不能进行属内不同种病毒的区分。

3.1 中和试验

Samojlović 等[30]利用MDBK 细胞分离培养的LSDV 与接种疫苗的血清抗体开发了LSD 的VNT 检测方法。检测免疫后不同时间点采集的奶牛血清样品200 份，结果VNT 法检出68 份阳性（34%），商品化ELISA 试剂盒检出60 份阳性（30%）；检测血清库中125 份阴性牛血清样品，结果VNT 法未检出阳性，商品化ELISA 试剂盒检出1 份假阳性。

Tuppurainen 等[31]通过牛高免血清建立检测LSDV 血清中和试验，检测6 头人工感染LSDV 的肉牛，发现可在接种后16～71 d 内检出血液样品中的LSDV 抗原，最高血液样品稀释度为1:160。

3.2 ELISA 法

Bowden 等[32]基于羊痘病毒属核心蛋白ORF095 和ORF103，建立了间接ELISA 检测方法，用于检测羊痘病毒属病毒感染的血清抗体。实验条件下，检测LSDV 强毒感染的肉牛血清、GTPV强毒感染的山羊血清、SSPV 强毒感染的绵羊血清，结果敏感性和特异性为95%～97%；而检测相应减毒活疫苗免疫的山羊或绵羊血清，敏感性仅为30%。该方法与羊口疮病毒样品不发生反应。

Carn[33]建立了检测组织培养上清液和活检组织中羊痘病毒属抗原的捕获ELISA 方法，最早可于LSDV 感染后7 d 检出组织活检样品中的抗原，检测限为102.8TCID50。该方法检测不同来源的羊痘病毒属病毒感染的组织活检样品10 份，结果检出阳性9 份，即LSDV 样品2 份、SPPV 样品4 份、GTPV 样品3 份，而同步进行的VNT 检测结果均为阳性；检测羊口疮病毒、痘苗病毒、骆驼痘病毒、水牛痘病毒、蓝舌病病毒样品8 份，结果均为阴性，与VNT 检测结果一致。

3.3 其他方法

Gamil 等[34]应用羊痘病毒属抗原免疫牛血清建立的间接免疫荧光抗体检测法（indirect fluorescent antibody technique，IFAT），可用于LSD 皮肤活检样品的检测，但会与羊口疮病毒等其他痘病毒属发生交叉反应。

Chand[35]与Venkatesan 等[36]采用羊痘病毒感染的细胞裂解物建立的蛋白印迹试验（western-blot，WB）方法，可用于检测血清中长度为32 kDa 的羊痘病毒属病毒结构蛋白P32 的抗体。该方法的检测灵敏性和特异性较好，但受实验条件限制，难以用于临床检测。

Kitching[37]与Sharawi 等[38]建立了琼脂免疫扩散法（agar gel immunodiffusion test，AGID），用放射性35S 元素标记羊痘病毒属特异性抗原，可检测血清中的羊痘病毒属病毒抗体，但与牛丘疹性口炎病毒抗体和伪牛痘病毒抗体有交叉反应。检测患病水牛组织样品10 份，与平行的PCR 检测阳性率（100%）相比，琼扩阳性率仅为70%。

Haegeman 等[39]建立了一种检测LSDV 抗体的免疫过氧化物酶单层分析法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），可检测最高稀释度为1:50 的牛血清。检测LSDV 实验感染的牛血清样品116 份、LSDV 自然感染样品28 份，结果均为抗体阳性（100%），与VNT 和商品化ELISA 试剂盒检测阳性结果一致。该方法特异性良好，对口蹄疫病毒和蓝舌病病毒样品不发生反应。

4 结语

LSD 是一种新传入我国的外来动物疫病，有必要运用快速准确的检测方法加强监测。应用常规PCR、rPCR、HRM 等分子生物学方法，可实现LSDV 的特异性检测、羊痘病毒属不同种病毒的通用检测以及LSDV 野毒株与疫苗株的区分。目前，OIE 推荐PCR 方法用于LSD 的早期诊断、移动群体筛查以及疫病的根除和净化等。RPA、LAMP 等技术配合新型便携设备开发的临场检测方法不断投入实践应用，此外数字PCR、微控流等新型分子诊断技术也将是LSDV 分子诊断的研发方向。免疫学诊断方面，OIE 推荐应用VNT 进行流行病学监测、单个或群体接种疫苗后的免疫应答评估。现有的VNT、ELISA、IFAT、WB 等方法，通常用于检测羊痘病毒属的特异性抗体和感染性抗原，而LSDV 特异性抗体检测方法仍有待进一步研究。

对于LSD 的诊断，可根据相关临床特点，结合虫媒机制、发病季节等流行病学特征，选用相应的实验室方法进行诊断。一旦发现疫情，果断采取防控措施，防止扩散，以保护我国养牛业健康发展。