赵 磊，张会敏，李煜彬，郝 帅，陈艳麟，徐 杰，王成涛

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048）

烧烤是肉制品传统的加工方式之一[1]。肉制品含有丰富的蛋白质，在烤制过程中易生成一类具有致癌、致突变作用的有机物——杂环胺[2-4]。杂环胺可分为氨基咪唑氮杂芳香烃（aminoimidazo azaarens，AIAs）和氨基咔啉（amino-carbolines）两大类，其化学结构和产生机制也有所不同[5-6]。AIAs是由肌酸/肌酐、氨基酸和还原糖在300 ℃以下缩合聚合形成的，主要有2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，MeIQx）、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine，PhIP）、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f] quinoline，IQ）等；而氨基咔啉是氨基酸和蛋白质在300 ℃以上的高温条件下热裂解产生的[7-8]，主要有3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC）、2-氨基-6-甲基吡啶[1,2-a:3'2'-d]咪唑（2-amino-6-methylpyridine并[1,2-a:3'2'-d]imidazole，Glu-P-1）、2-氨基-二吡啶并[1,2-a:3'2'-d]咪唑（2-amino-dipyrido[1,2-a:3'2'-d]imidazole，Glu-P-2）。也有一些氨基卡啉类杂环胺可在100 ℃生成，如β-咔啉类1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Norharman）等[9]。迄今为止，人类已经在食用肉制品中发现了30多种杂环胺[10-11]。随着人们对于健康饮食的追求日趋强烈，有效抑制热加工肉制品中杂环胺的生成成为当前研究的热点。

黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，根据结构可主要分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷醇类和二氢黄酮类等[12-13]。研究表明一些黄酮类化合物如表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、木犀草素和槲皮素能够有效抑制MeIQx、PhIP、IQ等杂环胺的形成[14-15]。传统观点认为自由基反应参与了杂环胺的生成，抗氧化剂及植物提取物抗氧化成分能够清除美拉德反应中产生的吡啶和吡嗪等自由基，从而抑制杂环胺的生成[16-18]。Cheng等[19]在研究12 种酚类化合物对牛肉中PhIP含量的影响时发现，柚皮素、槲皮素等黄酮类化合物能够与PhIP生成中间产物苯乙醛结合，生成特定的化合物，淬灭活性羰基，从而阻断了苯乙醛与肌酸酐进一步反应，进而间接抑制PhIP的生成。然而，目前主要采用模拟体系研究黄酮类化合物对杂环胺形成的影响，模拟体系的理论在真实体系中是否适用尚有待考证，且在黄酮类化合物的选择上也缺乏系统性。因此，系统地选择不同类型的黄酮类化合物，探究其在实际烤肉体系中对杂环胺形成的影响，可为有效控制杂环胺生成、减少其对人类健康的危害提供理论参考。

本实验以烤鸡胸肉为对象，采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法[20-21]测定烤鸡胸肉中杂环胺含量，研究不同类型的黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺形成的影响，并运用主成分分析法比较15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺形成影响的差异性，以期为开发高效抑制杂环胺形成的天然添加物提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡胸肉 北京永辉超市；槲皮素、槲皮苷、山柰酚、儿茶素、表儿茶素、EGCG（纯度均为98%以上）成都瑞芬思生物科技有限公司；高良姜素、杨梅素、芹菜素、木犀草素、柚皮素、橙皮素、染料木素、大豆苷元、葛根素（纯度均为98%以上） 北京百灵威科技有限公司；Norharman、Harman、PhIP、IQ、2-氨基-3,4-二甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amine-3,4-dimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinolin，MeIQ）、MeIQx、2-氨基-3,4,8-三甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethy-3H-limidazo[4,5-f]quinoxaline 4,8-DiMeIQx）、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（4,7,8-TriMeIQx）（纯度99%以上） 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（均为色谱级） 美国Fisher Chemical公司；色谱级甲酸美国Mreda公司；Oasis MCX小柱（3cc/60 mg） 美国Waters公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

6460三重串联四极杆液相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司；MS105DU分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX-5漩涡振荡器 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；APE-12固相萃取装置 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；GM-0.33A真空泵 天津市津腾实验设备有限公司；CRTF-电烤箱 佛山市伟仕达电器实业有限公司；RS-JR09A绞肉机 合肥荣事达三洋电器股份有限公司；RV10旋蒸仪 德国IKA公司；NK200-1B氮吹仪 杭州米欧仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烤鸡肉饼的制备

鸡胸肉切小块，用绞肉机绞碎，每个肉饼称取40 g肉糜于小烧杯中，将0.05 mmol黄酮类化合物溶解在2 mL二甘醇中，倒入小烧杯与肉糜搅拌混合均匀，制成直径6 cm、厚1 cm的圆形肉饼，置于直径6 cm培养皿中[22-23]，置于4 ℃腌制12 h。将肉饼置于电烤箱中220 ℃烤制10 min，随后翻面再烤制10 min。同时以不添加黄酮类化合物的烤鸡肉饼作对照。烤制结束后立即冷却，随后将烤鸡肉饼冷冻干燥，并用粉碎机粉碎成粉末，放置于冰箱中-20 ℃贮存。

1.3.2 杂环胺的提取与分析

称取6 g烤肉粉末于锥形瓶中，加入25 mL 1 mol/L NaOH溶液，同时加入质量浓度为100 ng/mL的4,7,8-TriMeIQx的内标溶液，均质10 min，向均质后的膏状液体中加入15 g硅藻土，搅拌使其充分混合，随后加入50 mL乙酸乙酯，超声抽提30 min，过滤收集提取液，重复超声抽提一次，合并两次提取液，分液后取乙酸乙酯层，减压浓缩至10 mL。

将乙酸乙酯提取液上样到Oasis MCX固相萃取柱中，固相萃取柱在使用前依次经6 mL甲醇、6 mL超纯水以及6 mL 0.1 mol/L盐酸溶液润洗预处理，待提取液全部通过固相萃取柱后，先后以6 mL 0.1 mol/L盐酸和6 mL甲醇清洗固相萃取柱，最后用6 mL甲醇-氨水（95∶5，V/V）洗脱吸附在固相萃取小柱上的杂环胺[24-26]。将盛有洗脱液的试管用氮吹仪45 ℃下挥去溶剂，加入1 mL甲醇复溶，并采用0.22 μm尼龙针孔滤器过滤于进样小瓶中，进行UPLC-MS/MS检测，并按下式计算各黄酮类化合物处理组的杂环胺抑制率。

液相色谱条件：色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A相为体积分数0.1%甲酸溶液，B相为乙腈；梯度洗脱条件为0～10 min，10%～60% B；10～12 min，60%～90% B；12～13 min，90%～10% B；13～15 min，10% B。流速为0.2 mL/min；进样量，1 μL；柱温：25 ℃。

质谱条件：检测技术为多反应监控模式；离子化方式为正离子模式电喷雾二级质谱；毛细管电压额3.5 kV；碰撞能量为：IQ，31 eV；4,8-DiMeIQx，23 eV；Norharman，40 eV；Harman，39 eV；MeIQ、4,7,8-TriMeIQx，30 eV；MeIQx、PhIP，28 eV；离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为350 ℃；干燥气流速为10 L/min。

1.3.3 杂环胺测定的方法学考察

本研究对检测方法线性范围、最低检测限（limits of detection，LODs）和最低定量限（limits of quantification，LOQs）、加标回收率、精密度等方法学参数进行测试分析。

线性范围：以杂环胺标准品溶液与内标物（100 ng/mL 4,7,8-TriMeIQx）的质量浓度比为横坐标，以相应的杂环胺标准品与内标物的二级质谱峰面积比为纵坐标，绘制标准线性曲线，并计算线性回归方程和决定系数R2。

证明：由于ri(t)，ai(t)，b(t)，ci(t)，di(t)，ki(t)，αi(t)，βi(t)(i=1,2)为时标上的概周期函数，则存在序列{τn}，当n→∞时，有τn→∞，使得ri(t+τn)→ri(t)，ai(t+τn)→ai(t)，b(t+τn)→b(t)，di(t+τn)→di(t)，ki(t+τn)→ki(t)，αi(t+τn)→αi(t)，βi(t+τn)→βi(t)，i=1,2.

LODs和LOQs：将7 种杂环胺的混合标准品溶液逐级稀释，然后进行测定，分别记下当杂环胺色谱峰达到3 倍信噪比（RS/N）和10 倍RS/N时的杂环胺标准品质量浓度，即为仪器对各种杂环胺的LODs和LOQs，单位为ng/mL。

加标回收率：向空白烤鸡胸肉样品中加入3 种不同剂量（10、50、100 ng/g）的杂环胺混合标准品溶液后，采用上述前处理方法对杂环胺进行提取和净化，最后测定杂环胺的含量。测得的杂环胺的含量与加入杂环胺标准品含量的比值，即为方法的回收率。

精密度：向空白烤鸡胸肉样品中加入杂环胺混合标准品工作液后，制成待测样品。记录连续5 d内对相同的加标样品测定所得的杂环胺含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），即为精密度。

1.4 数据处理与分析

实验结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan法，P＜0.05为差异显著。采用SPSS 19.0软件进行主成分分析（principle component analysis，PCA），比较不同黄酮类化合物对杂环胺形成影响的差异。

2 结果与分析

2.1 杂环胺检测的方法学考察

采用1.3.2节方法对烤鸡胸肉中杂环胺进行处理和含量分析，所得的方法学数据如表1所示。结果显示，该方法的R2均大于0.999 2，对IQ、MeIQ、MeIQx和4,8-DiMeIQx的线性范围为0.5～100 ng/mL，对Harman和Norharman的线性范围为5～500 ng/mL，对PhIP的线性范围为1～200 ng/mL。按RS/N为10确定定量限，样品加标后测得该方法的LOQs范围为0.039～0.249 ng/mL，满足对于痕量杂环胺进行检测的要求。选择空白烤鸡胸肉进行3 个水平的加标回收实验，测得回收率可达60.27%～83.22%。精密度实验结果表明，该方法的日间RSD均在5.42%以下，说明该方法结果稳定、重现性良好。

表1 杂环胺检测的方法学数据Table 1 Methodological data for heterocyclic amines detection

2.2 15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺含量的影响

由表2可知，黄酮类化合物对Norharman的抑制作用由高到低依次为：染料木素＞EGCG＞木犀草素＞葛根素≈大豆苷元≈柚皮素≈橙皮素＞儿茶素≈表儿茶素＞槲皮素≈槲皮苷＞高良姜素。其中，染料木素对Norharman形成的抑制率最高，为29.22%；EGCG效果次之，抑制率可达22.27%。而芹菜素、山柰酚、高良姜素和杨梅素均对Norharman的形成有促进作用。黄酮类化合物对Harman的抑制作用由高到低依次为：染料木素≈木犀草素＞EGCG。染料木素和木犀草素对Harman的抑制率最高，分别为30.92%和28.95%。而芹菜素、高良姜素、柚皮素、槲皮苷、槲皮素、大豆苷元、儿茶素、表儿茶素、葛根素、山柰酚、杨梅素和橙皮素对Harman的形成有促进作用。黄酮类化合物对PhIP的抑制作用由高到低依次为：EGCG≈柚皮素＞木犀草素＞染料木素＞高良姜素≈葛根素≈表儿茶素。其中EGCG对PhIP的抑制率最高，为57.29%；其次为柚皮素和木犀草素，对PhIP的抑制率均在45%以上。而儿茶素、槲皮素、橙皮素、芹菜素、山柰酚、大豆苷元、杨梅素和槲皮苷对PhIP的形成有促进作用。黄酮类化合物对MeIQx的抑制作用由高到低依次为：染料木素＞柚皮素＞木犀草素＞高良姜素＞山柰酚≈大豆苷元≈芹菜素＞EGCG＞葛根素≈表儿茶素＞橙皮素＞槲皮素。其中染料木素对MeIQx的抑制率最高，为71.57%；柚皮素和木犀草素对MeIQx的抑制率均在55%以上。而槲皮苷、儿茶素和杨梅素对MeIQx的形成有促进作用。黄酮类化合物对4,8-DiMeIQx的抑制作用由高到低依次为：柚皮素＞高良姜素≈山柰酚≈染料木素＞木犀草素＞EGCG＞葛根素≈橙皮素＞大豆苷元≈槲皮素＞杨梅素。其中柚皮素对4,8-DiMeIQx的抑制率最高，为64.09%；柚皮素、高良姜素、染料木素和山柰酚对4,8-DiMeIQx的抑制率均在45%以上。而芹菜素、表儿茶素、槲皮苷和儿茶素对4,8-DiMeIQx的形成有促进作用。部分黄酮类化合物对杂环胺的形成有促进作用，尚不清楚是何原因导致，需要进一步研究。15 种黄酮类化合物中仅EGCG、染料木素、木犀草素和柚皮素对烤鸡胸肉中杂环胺总量显示出明显的抑制作用，抑制率可达27%以上。

表2 15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺的抑制率Table 2 Inhibition rates of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast%

秦川[27]研究了8 种黄酮类化合物对烤牛肉中杂环胺PhIP含量的影响，研究结果显示根皮苷、EGCG、槲皮素和柚皮素对PhIP的抑制效果最佳，与本研究中EGCG和柚皮素对PhIP的抑制效果较好相一致；而本研究中槲皮素对PhIP生成有促进作用，且槲皮素的添加量（0.125 mmol/100 g鸡肉糜）低于秦川[27]研究中槲皮素的添加量（0.5 mmol/100 g碎牛肉），推测可能是由于原料肉的种类、肉前处理的方式以及槲皮素所选剂量等的差异导致。Puangsombat等[28]研究5 种香料对煎牛肉饼中杂环胺MeIQx和PhIP的抑制作用时发现，高良姜素对煎牛肉中MeIQx和PhIP也有一定的抑制作用，与本研究结果一致。

2.3 基于主成分分析的15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺形成的影响

图1 15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺的PCA得分图Fig. 1 PCA score scattering plot for the inhibitory effects of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast

为研究15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺谱的影响，通过主成分分析的方法研究15 种黄酮对烤鸡胸肉中5 种杂环胺的抑制作用之间的差异性。如图1所示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的贡献率分别为62.92%和20.19%，累计贡献率达83.11%，能较好地反映杂环胺谱的信息。表儿茶素、槲皮素、橙皮素、葛根素、大豆苷元和芹菜素聚集在一起，说明这6 种黄酮类化合物对杂环胺形成的影响彼此间差异较小；儿茶素和槲皮苷聚集在一起，说明二者对于杂环胺形成的影响差异较小，二者均对Norharman的形成有抑制作用，对Harman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx的形成有促进作用；EGCG、木犀草素和染料木素聚为一类，分布在第一主成分轴的右边和第二主成分轴的上边，在PC1和PC2上得分均较高，说明这3 种黄酮对于杂环胺形成的影响差异较小，对5 种杂环胺（Norharman、Harman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx）均有较强的抑制作用；柚皮素分布在第一主成分轴的右边，且在PC1上得分较高，其对Norharman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx这4 种杂环胺均有较强的抑制作用。此外，杨梅素、山柰酚和高良姜素分布比较分散，与其他黄酮类化合物之间没有明显的分组现象，同时说明这3 种黄酮类化合物与其他黄酮类化合物之间对于杂环胺的影响差异较大。

在因子载荷图上，每一个变量都体现出其对样品在得分图上分布的贡献，载荷图中距离原点越远说明此因子对样品分类的贡献系数越大。通过分析图2可知，在PC1方向上距离中心点最远的杂环胺分别为PhIP和MeIQx，说明这两种杂环胺是不同黄酮类化合物处理后的杂环胺谱在PC1上分离的关键杂环胺，其形成受到黄酮类化合物的影响较大。第二主成分PC2主要与Norharman和4,8-DiMeIQx有关。结合图1、2可以得出，EGCG、木犀草素和染料木素处理组对应的杂环胺为Norharman、Harman和PhIP，可见EGCG、木犀草素和染料木素能够较好地抑制烤鸡胸肉中Norharman、Harman和PhIP的形成；而高良姜素和柚皮素处理组对应的杂环胺为MeIQx和4,8-DiMeIQx，说明高良姜素和柚皮素能够较好地抑制烤鸡胸肉中喹喔啉类杂环胺MeIQx和4,8-DiMeIQx的形成。

图2 15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺的PCA载荷图Fig. 2 PCA loading plot for the inhibitory effects of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast

如表3所示，对烤鸡胸肉中杂环胺抑制作用效果较好的黄酮类化合物分别是木犀草素、染料木素、柚皮素以及EGCG，这4 种黄酮类化合物的化学结构式如图3所示。通过分析15 种黄酮类化合物的结构特征发现：1）异黄酮类中大豆苷元和葛根素对杂环胺的抑制效果相对较差，经比较这两种化合物的结构中A环仅含有7-羟基，而其他黄酮类化合物均同时存在5-和7-羟基，由此推测，黄酮母核中同时存在的5-和7-羟基可能对黄酮类化合物有效抑制杂环胺的形成起到重要作用；2）槲皮素、山柰酚等黄酮醇类以及儿茶素和表儿茶素对杂环胺形成的抑制作用相对较差，推测可能由于黄酮母核C环的3-羟基对其抑制杂环胺形成有相反的作用；3）二氢黄酮类化合物中，柚皮素较橙皮素对杂环胺形成有更好的抑制作用，可能与黄酮母核B环中的4'-羟基有关。刘莉华等[29]研究表明，黄酮类中B环的4'-羟基的存在可以延长黄酮体的共轭体系，使整个分子的电子云分布离域，有助于黄酮类化合物形成相对稳定的自由基中间体。同时，4'-羟基供氢后易与3'位的氧共享3'-羟基的氢而形成分子内氢键，从而进一步提高3',4'-邻二羟基黄酮自由基的稳定性。由此推断芹菜素和木犀草素对杂环胺形成的抑制作用，可能与其抗氧化作用有关。综上，推测黄酮母核结构中A环同时存在5-和7-羟基，以及B环的4'-羟基对黄酮类化合物有效抑制烤鸡胸肉中杂环胺的形成具有重要的作用，而C环中3-羟基的存在会降低黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺形成的抑制作用。此外，EGCG对杂环胺的强抑制作用可能与其结构中具有6 个邻位酚羟基有关。黄酮类化合物的各活性部位和重要官能团在抑制杂环胺形成中的作用还有待进一步研究。

表3 15 种黄酮类化合物的化学结构示意图Table 3 Chemical structures of 15 flavonoids

图3 木犀草素（A）、EGCG（B）、染料木素（C）和柚皮素（D）的化学结构式Fig. 3 Chemical structural formulae of luteolin (A), EGCG (B),genistein (C) and naringenin (D)

3 结 论

本研究采用UPLC-MS/MS法对杂环胺含量进行测定，并采用主成分分析法考察15 种黄酮类化合物对烤鸡胸肉中杂环胺形成影响的差异性。结果表明，15 种黄酮类化合物中木犀草素、EGCG、染料木素和柚皮素对烤鸡胸肉中杂环胺的形成具有明显的抑制作用。黄酮母核中A环同时存在5-和7-羟基，以及B环的4'-羟基对黄酮类化合物抑制杂环胺的形成可能具有重要作用，而C环的3-羟基会降低其对杂环胺形成的抑制作用。黄酮类化合物广泛存在于各种蔬菜、水果及药用植物中，具有诸多生物活性及保健作用。本研究有助于推动天然黄酮类化合物在热加工肉制品中的应用，降低人类杂环胺的暴露量，提高食品安全性，保障消费者身体健康，具有重要的理论和实践意义。