郭 钧 刘 铖 周 举 倪 昱 罗 睿 江 宁 隋加红

(1 清华大学第一附属医院骨科，北京市 100016，电子邮箱：yxbjb0052@163.com；2 中国人民解放军总医院第五医学中心南院区骨科，北京市 100039)

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，常发生于长骨干骺端和膝盖，多发于青少年，骨肉瘤恶性程度高，早期易发生远处转移[1]。随着手术结合新辅助或辅助化疗方案的应用，骨肉瘤5年生存率维持在60%～80%，但局部复发或转移的患者预后较差，5年生存率不足30%[2-3]，因此，寻找到可靠的评估预后的指标，对指导治疗方案的制订和预测疗效具有重要意义。X线、CT、正电子发射断层扫描、磁共振成像等影像学检查，是诊断骨肉瘤和评估其治疗效果的重要方式，但由于价格昂贵，一般用于疾病的确诊，不用于疾病早期的筛查。AKP是骨肉瘤已知的血清标志物，但在青少年尤其是儿童中，血清AKP水平普遍升高，且器官损伤后也影响其水平，易产生假阳性结果[4]，因此，寻找高灵敏度、特异性和微创的骨肉瘤生物标记物，对指导骨肉瘤的治疗具有重要价值[5]。近年来，有研究显示，微小RNA表达异常是导致恶性肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭和转移的重要因素，活跃的肿瘤细胞可分泌微小RNA入血，分析患者血液循环中微小RNA水平为癌症筛查或监测提供了新的方式[6]。目前，对于骨肉瘤，尚无一致的循环微小RNA标志物。本研究通过检测骨肉瘤患者血清微小RNA-25-3P的表达水平，初步探讨其对骨肉瘤诊断和预后评估的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月至2016年11月在中国人民解放军总医院第五医学中心南院区及清华大学第一附属医院就诊的74例骨肉瘤患者作为研究组，纳入标准：(1)病理组织学检查确诊为骨肉瘤；(2)发病部位为四肢，首次诊断，既往未行过放疗、化疗等抗肿瘤治疗；(3)患者对研究知情并签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他部位恶性肿瘤者；(2)合并严重心、肝、肾功能障碍者；(3)妊娠期、哺乳期女性；(4)合并自体免疫性疾病或接受糖皮质激素治疗者。选取同期在我院接受健康查体的57例健康者作为对照组。两组性别、年龄、体质指数等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究通过医院伦理审查批准，患者对本研究知情并签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2 主要仪器和试剂 PCR基因扩增仪购自西安天隆科技有限公司(型号：DTC 3G plus)，荧光定量PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司(型号：SLAN-96P)，-80℃冰箱购自青岛海尔公司(型号：DW-86L388J)，台式高速离心机购自上海珂淮仪器有限公司(型号：Eppendorf 5427R)。PrimeScript RT reagent kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司(批号：RR037A)，TaqMan® MicroRNA Assays购自美国应用生物系统公司(批号：4365409)，LightCycler®480 Probes Master购自瑞士罗氏公司(批号：04 707 494 001)，InvitrogenTMTRIzolTMLS 试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司(批号：10296010)。

1.3 循环微小RNA-25-3P表达水平的检测 抽取两组研究对象清晨空腹静脉血2 mL，其中研究组在接受术前辅助化疗之前采集标本。使用乙二胺四乙酸二钠进行抗凝，室温下静置1 h，3 500 r/min离心5 min，吸取上层血清置于干燥洁净EP管中，-80℃低温保存，使用Invitrogen TRIzolTMLS试剂盒提取总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用PrimeScript RT reagent kit将提取的RNA反转录为cDNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。20 μL反应体系包括4.0 μL总RNA、2.0 μL 微小RNA-39反转录引物、10 μL反转录缓冲液、1 μL反转录酶和3 μL焦碳酸二乙酯水；反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。以miR-39作为内参进行PCR实验。微小RNA-25-3p上游引物：5′-CAUUGCACUUGUCUCGGGGUCUGAAG-3′，下游引物：3′-GAGCAACGUGAACAGAGACAGACU-5′；内参微小RNA-39上游引物：5′-AGUGGCCCACAUUUAGUCGAAC-3′，下游引物：3′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-5′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。10 μL定量PCR反应体系包括LightCycler® 480 Probes Master(2×)5 μL、TaqMan® MicroRNA Assays(20×)0.5 μL、cDNA 1 μL、Nuclease-free H2O 3.5 μL；反应条件为95℃预变性10 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s共40循环，40℃ 10 s冷却。所有样品设置3个副孔，反应结束后获得溶解曲线及循环阈值，取其平均Ct值，采用2-△△Ct计算目的基因相对表达量。

1.4 治疗方法 74例患者中，最终接受保肢手术43例，截肢手术31例。所有患者手术前后均接受辅助化疗，术前化疗主要药物有氨甲蝶呤、阿霉素、顺铂、环磷酰胺，术后根据患者情况调整用药，化疗时间为6～12个月。患者出院后，通过微信、QQ、电话、复查等方式进行定期随访。以研究对象入组时间为观察起始时间，患者因原发疾病死亡为终点事件，研究结束时患者存活、死于其他原因或研究期间失访为截尾事件。

1.5 临床资料的收集 记录患者的一般资料及临床资料，包括年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、Enneking外科分期、是否合并病理性骨折、手术方式、辅助化疗次数、远处转移情况等。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验；计数资料以例数或百分比表示，比较采用χ2检验；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估循环微小RNA-25-3P诊断骨肉瘤的效能；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及计算生存率；采用log-rank检验进行单因素分析，将P<0.1的变量纳入多因素分析，采用Cox风险回归模型进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象循环微小RNA-25-3P表达水平及其对骨肉瘤的诊断价值 研究组血清微小RNA-25-3P相对表达水平为1.29±0.62，低于对照组的4.46±1.37(t=-16.227，P<0.001)。ROC曲线分析结果显示，血清微小RNA-25-3P相对表达水平诊断骨肉瘤的最佳截断值为2.56，其灵敏度、特异性分别为0.905、0.982，曲线下面积为0.977(P<0.001，95% CI：0.956～0.998)，见图1。

图1 循环微小RNA-25-3P相对表达水平诊断骨肉瘤的ROC曲线

2.2 74例骨肉瘤患者预后情况 末次随访截止时间为2018年11月30日，74例骨肉瘤患者均完成随访，随访率100%，随访时间5～80个月，中位随访时间39个月，患者1年、3年生存率分别为83.51%和43.98%，见图2。

图2 74例骨肉瘤患者总生存曲线

2.3 影响骨肉瘤患者预后的单因素和多因素分析 单因素分析结果显示，不同年龄组、性别、肿瘤大小、Enneking外科分期、辅助化疗次数、远处转移情况、循环微小RNA-25-3P表达水平的患者之间，生存曲线比较差异均有统计学意义(均P<0.1)，见表2。以单因素分析中有统计学意义的变量为自变量，以术后生存情况为因变量，进行多因素Cox回归模型分析，变量赋值见表3。多因素Cox回归分析结果显示，辅助化疗次数、远处转移情况、循环微小RNA-25-3P表达水平是骨肉瘤患者生存的独立影响因素(均P<0.05)，其中未远处转移及循环微小RNA-25-3P相对表达水平≥1.56为骨肉瘤患者术后生存的保护因素，辅助化疗次数<6次为其生存的危险因素，见表4。

表2 影响骨肉瘤患者术后生存的单因素分析

注：*通过绘制ROC曲线，以循环微小RNA-25-3P水平预测患者3年生存的截断值作为循环微小RNA-25-3P的分界值。

表3 多因素分析自变量赋值表

表4 影响骨肉瘤患者术后生存的多因素分析

3 讨 论

微小RNA是一种不编码蛋白质的内源性单链小分子RNA，在维持调节细胞功能中具有必不可少的作用。近年来，有研究表明，微小RNA与细胞的增殖、分化、凋亡等密切相关，其发生异常可导致基因缺失、突变、基因调控的异常，进而参与肿瘤的发生发展[7]。与信使RNA或小核RNA相比，循环中微小RNA在血液和细胞培养基中具有良好的稳定性，在恶性肿瘤患者外周血中稳定表达[8]。目前，在乳腺癌[9]、肺癌[10]、胃癌[11]、肝癌[12]、肾癌[13]、膀胱癌[14]及其他多种癌症患者中，均发现循环微小RNA的差异表达，这为肿瘤生物学特性研究和治疗干预的监测提供了新的思路。

目前，已经有研究结果显示，骨肉瘤患者血液中微小RNA表达异常，其外周血中单个核细胞的微小RNA-21水平[3]、血浆微小RNA-181b水平[15]、循环微小RNA-34b水平[16]均升高。但多数研究主要关注骨肉瘤患者血液中微小RNA的表达水平，而非循环中的微小RNA表达水平是否能客观反映肿瘤组织中微小RNA表达情况的存在争议。Pigati等[17]指出，循环微小RNA虽被评估为乳腺癌或其他癌症的生物标志物，但当细胞选择性释放或保留微小RNA时，循环微小RNA水平可受到影响，从而会对诊断结论产生干扰。Chan等[18]发现，在乳腺癌患者的肿瘤组织中有20种微小RNA异常表达，在血清中仅有7种微小RNA表达上调。因此，循环微小RNA水平并不能完全反映肿瘤微小RNA的表达情况，需要进一步筛选骨肉瘤的循环微小RNA。

牛敏等[19]研究发现，血清中微小RNA-25的表达下调与骨肉瘤的肺部转移显著相关，可作为预测骨肉瘤肺部转移的指标。Li等[20]发现，骨肉瘤患者血清循环微小RNA-25-3P水平明显低于健康对照组，其可作为诊断和预测骨肉瘤的生物学标志物。本研究在该研究的基础上进一步通过平衡各种临床因素，分析循环微小RNA-25-3P与骨肉瘤预后相关性。结果显示，骨肉瘤患者血清循环微小RNA-25-3P相对表达水平低于对照组(P<0.05)，且血清微小RNA-25-3P相对水平为2.56时诊断骨肉瘤的曲线下面积达0.977(P<0.05)，提示其对骨肉瘤具有较高的诊断价值，这与Li等[20]的研究结果相似。进一步采用多因素Cox回归模型分析骨肉瘤患者预后的影响因素，结果显示，血清微小RNA-25-3P水平是影响骨肉瘤患者生存情况的因素之一，血清微小RNA-25-3P相对表达水平≥1.56的骨肉瘤患者术后死亡风险降低。

综上所述，循环微小RNA-25-3P水平对骨肉瘤的诊断和预后评估均有一定临床价值，有望成为诊断骨肉瘤和评估基预后新的标志物，但所得研究结果值得进一步研究探讨。