周永红 周慧敏 康 岩

(1 河北省石家庄市妇幼保健院营养科，石家庄市 050050，电子邮箱：zhouyonghong8193@163.com；2 河北医科大学第一医院内分泌科，石家庄市 050023)

流行病学研究表明，有28.8%的糖尿病患者在发病5年以内发生糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，而病程达15年以上者有77.8%发生DR[1]。DR患者有不同程度的视力障碍，当新生血管大量出血至玻璃体腔时，视力将完全丧失，对患者日常生活造成严重影响[2]。因此，DR的早期综合防控将是未来研究的重点，寻找DR发生、发展的早期标志物，对DR的早期综合防控具有重要意义。微小RNA是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA分子，主要通过碱基互补与靶mRNA的3端非翻译区结合，从而发挥调控基因表达的功能[3]。研究显示，微小RNA在视网膜发育及病变过程中起到重要作用，可能成为潜在标志物[4]。有学者发现，微小RNA-181a可通过调控免疫细胞的增殖与分化，参与DR的发病[5]。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是能特异性地促进血管内皮细胞生长的细胞因子，在视网膜缺血缺氧性病变的新生血管形成过程中起重要作用[6]。本研究探讨DR患者微小RNA-181a与VEGF水平的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年6月至2018年6月河北医科大学第一医院收治的85例2型糖尿病患者。纳入标准：(1)符合2010年美国糖尿病学会制定的2型糖尿病诊断标准[7]；(2)抽血前未接受眼部相关治疗。排除标准：(1)有肝、肾等功能不全者；(2)出现2型糖尿病急性并发症者；(3)神经、精神疾病患者，无法配合治疗；(4)合并良性或恶性肿瘤者；(5)外伤所致视网膜病变。根据眼底检查和眼底荧光血管造影结果，将患者分为无视网膜病变(non diabetic retinopathy,NDR)组49例与DR组36例。另选取同期至河北医科大学第一医院体检的62例健康者为对照组。3组研究对象的临床资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。研究对象对本研究知情并签署知情同意书。本研究经河北医科大学第一医院伦理委员会审核批准。

表1 3组研究对象的临床资料比较

1.2 观察指标

1.2.1 生化指标：抽取3组研究对象(患者于治疗前、体检者于体检当日)清晨8:00空腹肘静脉血3 mL，采用酶联免疫比色法检测空腹血糖、LDL-C，检测仪器为日立7600型生化分析仪，相关试剂盒购自日立公司(批号：17012613、17121742)；采用离子交换高效液相色谱法检测糖化血红蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)，检测仪器为D10全自动糖化血红蛋白分析仪(美国Bio-Rad公司)，相关试剂盒购自美国Bio-Rad公司(批号：170428、180215)。

1.2.2 微小RNA-181a：于糖尿病患者入院次日、体检者体检当日,抽取其空腹肘静脉血4 mL，置于3.2%枸橼酸钠1 ∶9真空抗凝管中放入离心机，在4℃下4 000 r/min离心15 min后放入空试管中备用。在血清标本中加入总RNA提取试剂(北京旷博生物技术有限公司，批号：170423)2 mL，提取总RNA，置于-20℃保存备用。将RNA反转录为cDNA。以U6为内参，采用ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行实时荧光定量PCR。反应条件为95℃预变性1 min，95℃变性30 s，58℃退火5 s，共30个循环，70℃延伸5 s。实验重复3次。采用2-△△Ct法计算微小RNA-181a的相对表达水平。

1.2.3 VEGF：于糖尿病患者入院次日、体检者体检当日，抽取其清晨空腹肘静脉血2 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝，室温下2 500 r/min离心15 min，取血浆，采用美国Bio-Tek全自动酶标仪(型号：800ELX)进行酶联免疫吸附试验，双抗体夹心法检测VEGF，试剂盒购自北京晶美生物工程公司(批号：170528)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料以例数或率表示，比较采用χ2检验；正态计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验或单因素方差分析(多重比较采用SNK-q检验)；非正态计量资料以[M(P25，P75)]表示，多组采用Kruskal-WallisH检验进行分析，多重比较采用Nemenyi检验；采用Logistic回归模型分析影响因素；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组生化指标、微小RNA-181a、VEGF水平比较 与对照组比较，NDR组、DR组中的空腹血糖、LDL-C、HbA1c、VEGF水平升高，微小RNA-181a相对表达水平降低(均P<0.05)，且DR组的空腹血糖、LDL-C、HbA1c、VEGF水平高于NDR组，微小RNA-181a相对表达水平低于NDR组(均P<0.05)，见表2。

表2 3组生化指标、微小RNA-181a、VEGF水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与NDR组比较，bP<0.05。

2.2 糖尿病患者视网膜病变影响因素Logistic回归分析 以年龄(>53岁=1、≤53岁=0)、性别(男=1、女=0)、体质指数(>24.0 kg/m2=1、≤24.0 kg/m2=0)、LDL-C水平(>3.26 mmol/L=1、≤3.26 mmol/L=0)、HbA1c水平(>9.76 mg/dL=1、≤9.76 mg/dL=0)、微小RNA-181a相对表达水平(<2.48=1、≥2.48=0)、VEGF水平(>198.74 μg/L=1、≤198.74 μg/L=0)为自变量，以糖尿病患者是否合并DR为因变量(无=0、有=1)，进行Logistic回归分析。结果显示患者年龄>53岁、LDL-C水平>3.26 mmol/L、HBA1c水平>9.76 mg/dL、微小RNA-181a相对表达水平<2.48、VEGF>198.74 μg/L为DR的危险因素(均P<0.05)，见表3。

表3 糖尿病患者视网膜病变影响因素Logistic回归分析

2.3 血清微小RNA-181a与年龄、VEGF、LDL-C、HbA1c的相关性 对照组中，微小RNA-181a相对表达水平与年龄及VEGF、LDL-C、HbA1c水平均无相关性(均P>0.05)；NDR组和DR组微小RNA-181a与年龄无相关性(均P>0.05)，与LDL-C、HbA1c水平呈正相关，与VEGF水平呈负相关(均P<0.05)，见表4。

表4 血清微小RNA-181a相对表达水平与年龄、VEGF、LDL-C、HbA1c的相关性

3 讨 论

糖尿病患者的异常组织氧合作用，可引起微血管周围细胞变性、基底膜增厚和内皮细胞增生，导致视网膜血管病变，最终使视网膜无血流灌注、血管通透性增加、血管病理性增生，从而破坏患者视功能，甚至致盲，严重影响患者的生活质量[8-9]。目前DR的发生机制尚未明确，有学者认为DR属于慢性炎症，微血管病变为主要病理基础[10]。血清学指标简单、快速，是以往临床上诊断DR的实验室常用指标之一。既往研究表明，微小RNA通过诱导细胞分化、触发及调节炎症反应参与DR的发生发展，此外VEGF水平与DR发展过程也密切相关[11-12]。

微小RNA通过降解mRNA或抑制其翻译，来调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡[13]。随着分子生物研究的发展，有学者发现微小RNA参与新生血管的形成，通过转录后与VEGF mRNA的非翻译区结合，降低VEGF mRNA稳定性来负调控VEGF的表达，减少新生血管的形成，这对DR早期预防有着重要意义。研究表明，微小RNA表达的改变与DR发病密切相关[11]。DR最主要特征是视网膜微血管病变、视网膜新生血管形成等，VEGF在其中发挥重要作用。VEGF是血管生长因子家族成员之一，其对视网膜色素上皮细胞高度特异性有丝分裂具有重要的调控作用，能够刺激血管内皮细胞的分裂、增殖和趋化作用，使病变血管内皮细胞发生不同程度的迁移，增加视网膜微血管渗透性。VEGF与血管生长细胞表面VEGF受体结合，可诱导钙离子释放，破坏血-视网膜屏障，引起视网膜渗出、出血及水肿[14]。徐晨等[15]发现，VEGF-634C、VEGF-405G、VEGF-460C等水平升高与DR的病理生理过程有着密不可分的关系，能预测DR的发生。

本研究结果显示，对照组、NDR组、DR组的空腹血糖、LDL-C、HBA1c、VEGF水平依次升高，微小RNA-181a相对表达水平依次降低(均P<0.05)，提示血清微小RNA-181a及VEGF或可成为DR的有效诊断指标。研究表明，微小RNA与VEGF在DR发生发展过程中发挥重要的作用，两者可为DR的预防和靶向治疗提供思路[16]。本研究结果显示，微小RNA-181a相对表达水平<2.48及VEGF水平>198.74 μg/L均为2型糖尿病发生DR的危险因素(均P<0.05)，这与张莉等[17]的研究结果相似；此外，对照组的微小RNA-181a相对表达水平与血清VEGF水平均无相关性(均P>0.05)，而NDR组和DR组微小RNA-181a相对表达水平与VEGF水平呈负相关(均P<0.05)，这与吴心池等[18]的研究结果相似。这提示微小RNA-181a与VEGF密切相关，两者的相互作用可能促进了DR的发生发展。因此，血清微小RNA-181a水平降低及VEGF水平升高可能是糖尿病患者出现视网膜病变的预警信号，临床上应尽早采取有效的措施控制病情进一步发展[5,19]。

综上所述，DR患者血清微小RNA-181a水平降低，而VEGF水平升高，两者密切相关，其相互作用或在DR的发生发展中起重要作用。