郑 旭,顾丽丽,李 翀,韩燕燕

(天津中医药大学第一附属医院，天津300000)

据统计全世界育龄夫妇中有10%-15%患有不育[1]。遗传学因素是导致不育的重要因素之一。其中染色体病,包括性染色体数目和结构异常、常染色体倒位、易位等在无精症患者中可高达20%,在少精子症患者中也可达8%[2]。遗传因素导致的精子畸形同样是男性不育重要致病原因。除男性克氏征外,Y染色体微缺失占男性不育第2位。Y染色体微缺失检测的定位于Y染色体长臂上(Yq11)的无精子症因子(azoospermiafactor,AZF),存在多种与精子生成相关的关键基因位点[3]。本文主要研究天津地区男性不育患者中染色体变异和Y染色体微缺失类型及频率,分析两者联合检测的意义,为临床提供更详尽的诊断及治疗依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

挑选 2018年1月— 2018年12月到天津中医一附院门诊就诊的130例严重少弱精症和无精症患者,120例配偶有不良妊娠史患者,排除睾丸炎、输精管道梗阻以及炎症性输精管梗阻等病因。患者年龄在20-48岁之间,平均(31.1±5.6)岁,筛选出 130例为生精障碍组,年龄21-45岁,平均(31.6±5.9)岁；120例为配偶不良妊娠组,年龄 22-46岁,平均(32.3±6.4)岁；60例同期门诊精液常规检查正常者为对照组,年龄23-49岁,平均(32.7±6.1)岁。3组患者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1精液分析 按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第5版)》[4]的精液分析标准进行,精液离心沉淀涂片显微镜检查,计算机辅助精液技术分析：所有受检者均常规进行至少2次精液分析检查,对镜检未发现精子的受检者3次精液离心沉淀后仍未发现精子者定义为无精子症；精子浓度<15×106/ml时为少精子症。将无精子症和少精子症统称为生精障碍组。

1.2.2染色体核型检查 抽取患者外周血3 ml,进行外周血淋巴细胞培养,常规G显带方法制备染色体标本,分析计数20个中期分裂相,分析4-5个核型。结果分析按照人类细胞遗传学国际命名体制(2009)[5]进行。

1.2.3实时荧光PCR方法检测 Y染色体微缺失检测试剂盒由上海透景生命科技有限公司提供,实时荧光PCR扩增检测Y染色体AZF区域内的6个序列标签位点,即AZFa区：SY84,SY86；AZFb区：SY127,SY134；AZFc区：SY254,SY255。内对照为ZFX/ZFY基因和SRY基因。采用伯乐CFX-96荧光定量PCR仪进行扩增,扩增程序：第一阶段：50℃ 2 min,1个循环；第二阶段：95℃ 5 min,1个循环；第三阶段：95℃ 15 s,60℃ 35 s,72℃ 30 s,38个循环；第四阶段：72℃ 5 min,1个循环。在第三阶段收集 FAM/VIC/ROX/ Cy5荧光信号。当结果为典型的S型扩增曲线且Ct<32表示存在,否则表示缺失。

1.3 统计学处理应用 SPSS17.0统计学软件,计数资料选用χ2检验比较各组染色体异常率和Y染色体AZF基因微缺失检出率,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体异常核型检出率及分布

130例男性生精障碍患者中,14例(10.77%)染色体出现异常,其中 36例(27.69%)表现为染色体多态性。120例配偶不良妊娠组中,4例(3.33%)染色体出现异常,42例(35%)为染色体多态性改变。60例精液正常对照组中,无染色体异常患者,7例(11.67%)为染色体多态性改变。染色体异常情况具体见表1。染色体异常在生精障碍组与对照组间比较差异有统计学意义(χ2=6.263,P<0.05)。染色体多态改变在生精障碍组、配偶不良妊娠组与对照组间比较差异有统计学意义(χ2=4.007,P<0.05;χ2=6.751,P<0.05)。见表2。

表1 各组染色体异常核型情况(例)

表2 3组间异常染色体发生率比较[n(%)]

*与正常对照组比较,P<0.05；#与配偶不良妊娠组比较,P<0.05；△与配偶不良妊娠组比较,P>0.05

2.2 各组中Y染色体微缺失的类型

根据欧洲男性协会(European Academy of andrology,EAA)和欧洲分子遗传实验质控网(European molecular genetics quality network,EMQN)推荐标准,本方法可判断AZFa、AZFb、AZFc,共3个区域,6个STS的微缺失,设置两个内对照基因,男性性别决定基因(Sex．determining region of the chromosome,SRY)和编码锌指蛋白基因(Zinc finger protein,X—linked,ZFX；zinc finger protein．X—linked,ZFY)。在对照组中,未发现AZF异常。生精障碍组12例(12/130,9.23%)存在微缺失,配偶异常妊娠组8例(8/120,6.67%)存在微缺失,组间比较差异无统计学意义(χ2=0.582,P>0.05)。其中AZFa缺失只出现在生精障碍组中,配偶不良妊娠组与生精障碍组均以AZFc缺失为主,分别占比例是9例(9/12,75%)和7例(7/8,87.5%)。见表3。Y染色体缺失类型(图略)。

表3 Y染色体微缺失类型(例)

2.3 Y染色体微缺失合并染色体异常核型情况分析

Y染色体微缺失患者共有20例,其中合并染色体异常的有7例,(7/20,35%),包括4种异常核型,都和性染色体异常相关。AZFc缺失的比例最高 75%(15/20)。其余染色体异常患者的Y染色体微缺失位点均存在,未见缺失。见表4。

表4 Y染色体微缺失合并染色体核型分析结果

3 讨论

30%的男性不育由遗传因素引起,男性不育与遗传因素密切相关[6]。染色体数目异常、结构异常和多态性变异是常见的导致男性不育的遗传因素[7]。本研究中生精障碍组患者中异常染色体的检出率为10.77%,而正常对照组中未见染色体异常核型。结果表明精液情况差导致染色体异常核型检出率提高,尤其是性染色体的异常,如克氏征等对生精功能影响最大,这与Castro A[8]报道相符。在染色体核型异常中,克氏(Klinefelter)综合征 (47,XXY)最常见,也称先天性睾丸发育不全或原发性小睾丸症。以睾丸发育障碍和不育为主要特征,体征呈女性化倾向,大部分人无胡须、无喉结、体毛稀疏、阴毛呈女性分布。本文发现染色体畸变患者18例,其中10人为克氏综合征,占55.56%,均表现为无精症或少精症。证实性染色体异常是引起男性生精障碍的重要原因。与张永科等[9]报道一致。染色体畸变中发生率仅次于克氏综合征的为Y染色体倒位,占22.22%。本研究中生精障碍组患者染色体多态性改变占27.69%,明显高于对照组的11.67%(P<0.05)。说明染色体多态性改变可能对精子产生及功能有一定影响,目前仍需加大样本,进一步研究证实。

此外,本研究还发现配偶不良妊娠组患者的异常核型检出率3.33%,多态核型检出率为35%。一直以来,女性因素被认为是不孕不育的主要原因,而近几年的研究结果发现,在约50%的不孕不育夫妇中,男方因素是主要或者协同因素[10-12]。与本研究结果一致。提示配偶异常妊娠男性染色体核型分析检测更应引起特别重视。

Y染色体上的无精子症因子(AZF)与精子发生相关,AZF基因可分为AZFa、AZFb、AZFc三个区域,一个或几个区域的微缺失都会使精子生成障碍,导致少精子症或无精子症[13],Y染色体微缺失是导致男性不育的第二大遗传学因素。本研究采用的是PCR荧光探针法,与传统的多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳法相比,PCR荧光探针法加样例数多,每次可做48人份,节约时间与成本,准确性高,操作标准化,是目前国内外Y染色体微缺失检测的首选方法[14]。

欧洲男科学会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控网(EMQN)推荐使用SY84,SY86,SY127,SY134,SY254,SY255位点作为Y染色体微缺失检测位点,占欧洲人群的 95%。AZFa的缺失非常罕见,仅占男性不育Y染色体微缺失中的3%左右,整个区域缺失多表现为唯支持细胞综合征,为原发性无精子症[15]。AZFb区和 AZFbc区缺失几乎无精子症,病理类型为SCOS综合征或精子发生阻滞[16]。AZFabc区缺失表现为无精子症；核型检查通常是(46,XX male)或等臂双着丝粒Y染色体(iso(Y)*)[17]。AZFc区域缺失患者临床表型和睾丸组织学类型多种多样,以无精子症、严重少精子症、精子数进行性下降最为常见；多数患者有精子生成能力,可通睾丸穿刺获得精子,但是其男性后代将遗传这种AZFc微缺失。Y染色体微缺失检测者这种筛查方法简单无创,对男性不育患者具有诊断和预防价值[18]。

本研究250例不育患者中共发现20例Y染色体微缺失,占8%。稍高于李美珠等[19]检测的6.6%和陈琨发表的7.13%[20]。不同的民族、地区差异、纳入研究样本的标准以及标本量的不一致,都会得出不一致的结果数据[21]。本研究中AZFa缺失1例,AZFa+b+c缺失1例,AZFb+c缺失3例,AZFc缺失15例。说明在天津地区AZFc缺失占多数。这与Sabbaghian M[22]的研究一致。本文中生精障碍组共发现12例Y染色体微缺失,配偶异常妊娠组也存在8例Y染色体微缺失。提示生精障碍组和配偶异常妊娠组Y染色体微缺失发生率均较高。20例Y染色体微缺失患者中合并染色体核型异常的有3例。提示这两种检测不能相互替代。由于染色体核型分析只能观察到碱基对5Mb以上的问题,不能检测到微缺失,所以染色体核型分析及Y染色体AZF微缺失联合检测是首选。本研究还发现1例罕见的男性性反转患者,该患者社会性别为男性,染色体核型分析为46,XX,而Y染色体微缺失检测结果为AZFa、AZFb、AZFc及男性性别决定基因(SRY基因)均存在缺失,属于罕见类型,国内外鲜有报道较少,其发病原因和治疗原则尚不明确,有待进一步研究。

综上所述,男性不育与染色体异常核型高度相关,同样与Y染色体微缺失密切相关。对男性无精子症、少精子症患者和配偶异常妊娠患者进行常规染色体核型分析联合Y染色体微缺失检查是非常有必要的。这类患者中染色体异常核型概率大,其中Klinefelter综合征患者所占比例较高,同时,Y染色体微缺失风险也较高。对患者进行联合检查可以使临床医生进一步明确病因,进而决定是否进行辅助生殖,为是否需要进行胚胎植入前诊断提供临床帮助。所以,对男性不育症患者应进行染色体核型分析、Y染色体微缺失联合检查,两者相辅相成,是非常有意义、有必要的。