非洲猪瘟国内流行现状及诊断、防控

2019-12-24周仁江杨治聪黄先奇沈爱梅叶鹏曹昕郭莉侯巍阳爱国莫茜尹杰袁东波鲁志平郭万里曾子鑫

山东畜牧兽医 2019年12期

周仁江杨治聪黄先奇沈爱梅叶鹏曹昕郭莉侯巍阳爱国莫茜尹杰袁东波鲁志平郭万里曾子鑫

非洲猪瘟国内流行现状及诊断、防控

周仁江①杨治聪①黄先奇②沈爱梅②叶鹏②曹昕②郭莉③侯巍③阳爱国③莫茜③尹杰③袁东波③鲁志平④郭万里⑤曾子鑫⑥

（①四川省青神县动物疫病预防控制中心 620460 ②四川省眉山市动物疫病预防控制中心 ③四川省动物疫病预防控制中心四川成都 ④成都农业科技职业学院四川成都 ⑤四川省茂县动物疫病预防控制中心 ⑥四川省南充市嘉陵区动物疫病预防控制中心）

非洲猪瘟(African swine fever, 简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、高度致死性传染病。自2018 年8 月中国首例非洲猪瘟案例以来，短短数月，已席卷了全国31个省份，给我国养猪业造成了巨大的损失，形势异常严峻，因此开展非洲猪瘟诊断工作、病毒基础研究工作至关重要。本文分析了非洲猪瘟流行现状，并综述了研究学者在非洲猪瘟各种诊断技术、病毒基础研究、综合防控等方面的研究进展，对加强我国非洲猪瘟诊断技术的储备与制定非洲猪瘟防控措施提供参考。

ASF临床上以猪高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏实质器官出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，易感猪群的病死率高达100%。是一种严重的“世界经济”动物疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，在我国被列为一类动物疫病。ASFV不感染人，对人的健康不构成威胁。目前，针对ASF防控，尚无有效的商品化疫苗和治疗方法。

1 ASF流行与危害

2018年8月3号，中国动物卫生与流行病学中心诊断首次报道我国出现非洲猪瘟病例，截至今年8月26日，农业农村部通报通报疫情152起，涉及全国31个省(市、区)，其中野猪3起，家猪149起；共解除封锁148起，解除疫情省份28个；今年将近7个月的时间里，发生疫情53起。

表1 全国非洲猪瘟疫情形势

2 病原学特征

2.1 基因组庞大，易变异

非洲猪瘟病毒(ASFV)，属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，双股DNA，是唯一核酸为DNA的虫媒病毒，基因组长度约为170~193kb，是蓝耳病病毒的12倍，猪瘟病毒的15倍，口蹄疫病毒的24倍。其中基因组结构主要包含约125kb的中央保守区、38~47kb的左侧可变区和13~16kb的右侧可变区，基因组变异非常频繁，根据B646L基因的相似性，可以将ASFV分成24个不同的基因型，进一步根据P54和PB602L基因的中央可变区(CVR)序列，ASFV 的分型数量会更多。

附图基于ASFV B646L 基因的 24个基因型

2.2 存活时间长，抵抗力强

ASFV个体较大，直径200nm，表面为正二十面体和一层含类脂囊膜的对称结构病毒，因此高温和一些破坏囊膜的消毒剂均可有效杀灭ASFV。但是由于其复杂的分子结构，ASFV对消毒剂的抵抗力较其他的囊膜病毒稍强，特别是在一些猪肉制品或血液中存活时间更长。在血液、粪便和组织中可长期存活，冻肉中存活数年甚至数十年。广东省首例非洲猪瘟，疫点消毒7d后环境样品仍然能检测到病毒核酸。

表2 ASFV与FMDV耐受性

3 ASF的诊断

目前尚无针对ASF有效的治疗方法和疫苗，因此迫切需要快速的ASF检测及防控技术，以及时发现ASFV感染猪并及时扑灭疫情。目前，ASFV的检测技术主要有针对病毒DNA的核酸检测技术和基于病毒抗体反应的免疫学技术两大类。

3.1 ASF临床症状和病理变化

临床症状与病毒的毒力、感染的剂量和途径有关，可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性型无明显症状，突发高热后迅速死亡。急性型、亚急性型的病理剖解变化较明显，主要的病变器官为脾脏、淋巴结、肾脏和心脏。脾脏显著肿大(一般情况下是正常脾的3~6倍，颜色变暗，质地变脆，脾脏的变化是一种典型的病理变化)；淋巴结肿大、出血、变脆，有时血肿呈黑红色，切面呈大理石样；肾皮质和肾盂切面有点状出血；心脏斑点状出血，心包积液带有血液。慢性型主要发生于非洲野猪，感染猪几无临床症状。

3.2 血清学检测方法

3.2.1 红细胞吸附试验 HAD是ASF的确诊方法之一，通过用猪的血液或组织悬液接种原代白细胞培养物或制备感染猪血液白细胞培养物完成相应检测，镜检出现红细胞吸附在感染细胞的表面，呈现玫瑰花环或桑葚状现象，可判定为阳性。HAD需要观察的时间取决于病料中病毒的含量，通常需要3~10ｄ，有个别ASFV毒株没有红细胞吸附能力，因此目前逐步被PCR所代替。

3.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) 目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54等。ASFV感染猪7d左右即可检出IgM和IgG，并且IgG在感染猪体内能存在数年。目前以VP73蛋白、VP72蛋白、P54蛋白的商品化ELISA试剂盒被广泛应用，抗体检测试剂盒有ASF阻断ELISA试剂盒(Ingenasa，西班牙)等，抗原检测试剂盒有ELISA EZIM K3试剂盒(Ingenasa，西班牙)。

3.2.3 胶体金免疫层析(GICA)试纸条胶体金免疫层析技术是适合基层现场快速诊断和流行病学调查的一项检测技术。张鑫宇等原核表达Ｐ54重组蛋白，制作ASFV P54抗体检测胶体金免疫层析试纸，具有特异性强、敏感性高等特点。刘波(2014)也运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术，对ASFV快速检测试纸条的技术进行了研究。吴海涛(2018)运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体，制备了用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。

3.2.4 其他血清学方法荧光抗体试验(FAT)可以用作ASFV抗原检测的一种辅助方法，可用于检测野外可疑猪或实验室接种猪的脾、淋巴结等组织中的抗原，也可以鉴定无红细胞吸附能力的毒株。该方法具有快速、经济、敏感性和特异性高等优点，但需要专业试验人员，同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。因此仅作为ASFV的辅助检测方法。间接免疫荧光试验(IFA) 可用于检测感染ASFV的猪血清样品。该方法的优点是当ELISA检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时，可选用此法。免疫组化法是通用的检测方法之一，但对于临床症状不明显的病例，确诊有一定难度，因此，该方法仅作为ASFV的辅助检测方法。免疫印迹检测(immuno-blotting test)是将蛋白质电泳技术与血清学相结合的一种免疫生化技术，该方法特异性高，能简单客观的判定结果，能识别出弱阳性结果，可作为IFA替代方案对个别不确定结果进行确证。

3.3 分子生物学检测方法

3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) PCR具有简单快速、灵敏度高和特异性强的优点，是目前ASFV最常用的实验室检测方法。Aguero等(2003)和曾少灵等(2009)先后根据ASFV VP72基因建立了ASFV的PCR检测方法，均具有良好的敏感性和特异性，为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。崔尚金等(2012)建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法，采用纳米金颗粒作为热导介子，提高了PCR反应效率。

3.3.2 荧光定量PCR 实时荧光定量PCR比常规 PCR具有更高的敏感性和特异性，可同时快速检测大批量样品。Fernandez等(2013)利用通用探针库建立了ASFV的实时荧光定量PCR方法。王建华等(2016)根据ASFV CP530R基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因为靶序列，建立了可同时鉴别检测ASFV和PRRSV的二重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。崔贝贝等(2019)根据E184L基因建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法，方法能快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析，且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒２型等多种病原不存在交叉反应。

3.3.3 重组酶聚合酶扩增(RPA)技术 RPA是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术，该方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠。王建昌等(2016)基于ASFV VP72基因保守序列设计并合成引物，建立了ASFV RPA等温检测方法，为ASFV的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。吴映彤等(2018)基于ASFV多基因家族成员MGF360-12L基因序列，建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法，该方法操作简单、反应快速、检测成本低，为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。

3.3.4 线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)技术 LATE-PCR是不对称PCR的一种形式，该方法用于检测组织样品的病毒，其敏感性可以达到大约1拷贝的病毒DNA。Ronish等(2011)基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法，为ASFV的实验室诊断提供了敏感的检测方法。

3.3.5 环介导恒温扩增(LAMP)技术 LAMP 技术操作简单、灵敏、快速，检测成本远低于荧光定量PCR，且不需要特殊仪器设备，具有较高的临床实用性。JAMES等针对ASFV拓扑异构酶Ⅱ基因建立了一步法检测ASFV的LAMPs方法，最低可以检测到330拷贝DNA的病毒。国内学者均根据ASFV Ｐ72基因建立了ASF LAMPs检测方法，特异性良好，与常规PCR比灵敏度高，可用于ASF快速检测。邬旭龙(2014)根据ASFV K205R基因序列设计引物，建立了LAMP检测方法。

3.3.6 探针杂交技术张鑫宇等(2011)针对ASFV VP72基因建立了纳米金探针杂交方法。探针杂交技术检测灵敏度高，能有效排除PCR检测过程中的非特异性结果，省去了琼脂糖凝胶电泳步骤，操作简便、检测迅速，在酶标板中可批量反应，为ASFV核酸检测方法开辟了新的途径，但该方法的建立难度较高、操作较繁琐，对试验人员技术水平要求较高。

3.3.7 原位杂交原位杂交(insituhybridization，ISH)是将标记的核酸探针与组织细胞中待检核酸特异结合，再用检测系统检测标记探针，同时显示核酸所在的位置。BALLESTER等使用ISH技术，用地高辛标记的探针检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中的ASFV DNA，并取得较好的检测效果。

4 ASF的防控

4.1 政府应充分发挥自身主导作用，强制落实有效的ASF防控政策

4.1.1 向社会公众普及ASF危害性，动员公众参与到ASF疫情防控中做好ASF的社会科普工作，向全社会普及其危害，重点做好农村宣传工作，及时且合理的补贴生猪养殖者的损失，引导生猪养殖经营等重点环节从业者积极主动参与到ASF防控行动中，形成全民参与的ASF防控统一战线。

4.1.2 加大ASF疫情防控技术投入与创新，为ASF防控提供的技术支持 ASF疫情防控技术主要包括快速诊断、防控技术、疫苗研究等。由于非洲猪瘟病毒拥有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，使得目前全世界范围内尚无商品化安全有效的疫苗。专业领域的科研机构，要发挥科技人才优势，把疫苗研发作为战略性科技攻关项目来推动，力争尽早取得突破，为我国ASF疫情的有效防控提供重要科学依据，为检测技术和防治疫苗研发奠定了重要基础。

4.2 生猪养殖经营等重点环节从业者应发挥自身主体作用，积极配合政府的防疫工作

4.2.1 生猪养殖场(户)积极配合政府的疫情管理工作，做好猪场生物安全制度养殖场(户)应积极配合政府的疫情管理工作，主动了解ASF防控知识，提高对ASF疫情的甄别能力与应急能力。目前，猪场生物安全已成为养殖场(户)存活的关键所在，也是猪场防控非洲猪瘟唯一措施。按规定申报检疫，减少场外人员和车辆进入猪场，重点是做好猪群饲养管理，对猪群实施全进全出饲养管理，不散放饲养，避免家猪与野猪接触，提高饲养的生物安全水平。同时坚决不使用泔水或餐厨垃圾喂猪，切断饲养过程中一切可能的疫情传播途径，积极配合兽医人员做好每日排查工作。

4.2.2 生猪经营重点环节从业者，不进行违法生猪交易行为我国新闻报道已频繁揭露了许多不法分子“洗猪”、“炒猪”等违法交易行为，违法经营行为直接造成了染疫猪只及产品在全国各地的流通，加速了ASF在我国的扩散。生猪养殖、运销、屠宰、市场等重点环节从业人员应加强动物防疫法律的学习，树立动物防疫法律意识，遵守法律对生猪行业从业人员的规定与要求，时刻用不法分子承受的严重代价来警醒自己，发现可疑情况及时上报，不要隐瞒疫情，不给生猪交易过程中的人员创造违规操作的空间。

5 小结

（1）ASF作为一种重要的动物疫病，其病原结构和流行病学复杂，具有传染性强、死亡率高、缺少有效的疫苗预防等特征。在我国的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中，ASF被列为优先防范的13种重大外来动物疫病之一。从2018年8月3日以来，我国已有31个省(市、区)相继发生该疫情，目前非洲猪瘟疫情对我国养猪业造成严重威胁。因此，开展对ASF的相关研究，尤其是病原学、流行病学、诊断技术和疫苗等，将为ASF的防控奠定理论基础。（2）ASFV的实验室检测方法多种多样，各有优缺点，但对各种方法的检测结果均要求准确、快速、敏感，这不仅对感染ASFV的动物治疗非常重要，而且对未感染的动物及时采取有效的预防措施同样具有重要的意义。OIE推荐检测方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、ELISA等。用免疫学方法检测抗体可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，故ELISA等抗体检测方法在病毒早期监测工作中存在一定的局限性。PCR、实时荧光定量PCR、LAMP 等分子生物学技术在猪感染ASFV的早期即可检测到病毒核酸，在早期检测中具有重要作用。目前，动物疫病预防控制机构多采用经农业农村部批准、由青岛立见诊断技术发展中心生产的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂。（3）过去的几十年中，ASFV疫苗的研究虽取得了较大进展，包括评估细胞传代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是暂时都还未研制出可应用于实际生产的疫苗。通过基因重组技术，获得安全、高效ASFV减毒活疫苗仍是ASFV疫苗开发的首选策略。然而，仍有一些问题需要考虑，主要包括疫苗产生具备中和ASFV抗体，在体内的安全性研究，鉴别野毒感染和疫苗免疫，以及鉴定并开发适合弱毒活疫苗生产的细胞系等。今年4月，哈尔滨兽医研究所申请了基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用专利，但安全有效的疫苗要从实验室研究到大规模商业化量产，还有很长一段路要走。（4）ASF的暴发对我国养殖业既是空前的挑战，又将对我国养猪业及相关产业的发展产生深远的影响。截至2019年7月3日，中国31 个省(市、区)共发生143起ASF疫情，据报道大约有116万余头猪被扑杀以阻止疫情的传播。ASF疫情势必打击部分养猪从业者的养殖信心和补栏意愿，但对于重塑我国养殖产业格局、重新布局养猪业区域、改变现有落后的养猪模式、提高养殖户生物安全意识、终结泔水养猪、升级生猪调运装备等都有积极的推动作用。

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