万宇平 吴小胜 张瑜 杜美红 王兆芹 冯才伟 赵正苗 何方洋*

一种金黄色葡萄球菌核酸检测方法的建立

万宇平①③吴小胜①③张瑜①③杜美红②王兆芹①③冯才伟①③赵正苗①③何方洋①③*

（①北京勤邦生物技术有限公司 北京 102206 ②北京市理化分析测试中心 ③北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心）

通过对金黄色葡萄球菌的femA基因设计两对特异性引物，运用环介导等温扩增技术(LAMP)扩增基因的特定区域，探索出一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法。结果表明，该方法对金黄色葡萄球菌菌液检测的最低检出浓度为102~103CFU/Ml；使用不同浓度的金黄色葡萄球菌处理样品，不同样品LAMP方法检测结果与国标方法一致，两者符合率为100%。该方法中金黄色葡萄球菌的femA基因特异性引物及建立的LAMP方法能有效检测食品中的金黄色葡萄球菌，操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强，适用于不同层级的实验室及基层单位使用。

金黄色葡萄球菌 环介导等温扩增技术 快速检测

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属革兰氏阳性菌，是人类化脓感染中最常见的食源性病原菌[1]，耐高低温、耐高渗透，生存能力强，普遍存在于环境中，消毒等常规处理方法无法完全破坏其分泌的毒素[2]。误食金黄色葡萄球菌污染的食品可引起腹泻、呕吐等食物中毒反应，严重时可引起局部化脓感染，亦可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至引发败血症、脓毒症等全身感染，危及生命[3-5]。据统计，每年我国细菌性食物中毒占食物中毒事件总数的30%~90%，中毒人数占食物中毒总人数的60%~90%，严重影响了人民群众的生命健康[6]。食品中致病菌的超标也是影响我国食品出口的主要因素，每年都给我国造成了巨大的经济损失，同时也使我国食品在国际市场上的声誉受损，制约了我国农业和食品制造业的发展[7]。由于其危害性，全球各国都重视对金黄色葡萄球菌的预防监控及检测技术，我国农业部发布的《GB 29921-2013食品安全国家标准食品中致病菌限量》中规定金黄色葡萄球菌的限量为100CFU/g[8]。

目前检测金黄色葡萄球菌的主要方法有传统的国标法[9]、免疫学检测方法、分子生物学检测等技术，这些方法灵敏性和特异性比较高，但步骤较为繁琐，耗时长，操作复杂，大多需要昂贵的仪器设备，且受人为操作的影响较大，不能适用于现场的快速检测，难以在基层单位实现大面积的普及和推广应用。环介导等温扩增技术(LAMP)，是日本科学家 Notomi等[10]创建的一种新型核酸扩增技术，可针对靶基因设计能识别相应互补位点的4条特异性内、外引物，利用Bst DNA聚合酶在60~65℃等温条件下对其进行延伸，形成哑铃状DNA结构，随后，在此基础扩增，最终生成DNA片段混合物[10]。结果主要是通过凝胶电泳法、沉淀法、显色法等方法进行检测[11]。SYBR Green I作为一种高灵敏度的DNA荧光染料，安全无毒，结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域[12]，可检出20pb的DNA，灵敏度高。运用LAMP方法可简单、快速检测金黄色葡萄球菌，且灵敏度高，特异型强。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株 金黄色葡萄球菌CICC10477、金黄色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌CMCC(B)26069、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸭沙门氏菌CICC21498、沙门氏菌50001、肠炎沙门氏菌50041、肠炎沙门氏菌CICC21490、大肠埃希氏菌ATCC25922、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志贺ATCC2457T、单增李斯特菌CMCC(B) 54002、小肠结肠炎耶尔森菌CMCC(B)52225、阪崎肠杆菌来自军科院、金黄色葡萄球菌野生菌分离自饺子，粘氏沙雷氏菌、潘氏变形杆菌、奇异变形杆菌、溶血性葡萄球菌、微球菌、屎肠球菌均为野生菌。

1.1.2 仪器与设备 恒温水浴锅(美国WEALTEC CORR公司)、荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher 公司)、生化培养箱、高压灭菌锅、4℃离心机、Mini离心机、金属浴、超净工作台等。

1.1.3 试验试剂 生理盐水、致病菌相应的二次增菌液、脑浸液、无菌拭子、7.5%氯化钠、肉汤培养基、缓冲蛋白胨水培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、血平板、Bst DNA聚合酶、营养琼脂、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基、联合增菌液(北京良润生物科技有限公司)；DNA提取液：含0.5mol/L Tris-HCl、0.05mol/L 乙二胺四乙酸二钠、0.5%TritonX-100；10×Buffer反应缓冲液：含200mmol/L Tris-HCl(pH8.8，25℃)，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1% Triton X-100。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据金黄色葡萄球菌的femA基因的保守区域，利用生物学在线软件分析该基因的核苷酸序列，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，用Primer Explorer V4.0在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物1、外引物1、内引物2、外引物2，见表1。

表1 金黄色葡萄球菌LAMP引物序列

1.2.2 待检样品的处理、增菌 按照中华人民共和国国家标准GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中指定的方法对待检样品进行处理及增菌培养。

1.2.3 模板DNA的制备 （1）增菌液模板DNA的制备：取制备的待检样品增菌培养液1ml于1.5ml离心管中，10000r/min离心2min，弃上清；滴加100μl DNA提取液，入沸水浴10min；10000r/ min离心2min，上清即为模板DNA。（2）可疑菌落模板DNA的制备：分离挑取单菌落，加入到100μl DNA提取液中，振荡混匀，沸水浴10min；10000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

1.2.4 LAMP检测方法的建立 金黄色葡萄球菌LAMP反应体系见表2。

将配制好的反应液上方覆盖适量灭菌液体石蜡隔绝污染，并做阴性、阳性对照，其中阴性对照为DNA提取液，阳性对照为金黄色葡萄球菌标准菌株DNA提取物。将25μl LAMP反应体系配制成反应液后，65℃扩增60min。扩增完成后加入1~2µl 1000×SYBR Green I，混匀，肉眼观察颜色反应。在自然光下肉眼观察显色情况，在阴性对照呈橙色、阳性对照呈绿色的前提下，待检样品呈绿色判为阳性，即检测样品中含有金黄色葡萄球菌；待检样品呈橙色判为阴性，即检测样品中不含有金黄色葡萄球菌。若阴阳性对照与前述情况不符，则检测结果无效，应重新检测。

表2 金黄色葡萄球菌LAMP反应体系

1.2.5 特异性试验 分别对常见的21种食源性致病菌菌株及同源性高的菌株进行检测，同时设置金黄色葡萄球菌DNA为阳性对照，DNA提取液为阴性对照，每个样品重复2次。

1.2.6 敏感性试验 取计数后菌液进行10倍倍比稀释后，用建立的LAMP检测方法分别对其进行检测。

1.2.7 LAMP检测方法与国标检测方法的符合性试验 使用不同浓度的金黄色葡萄球菌处理猪肉、水饺、肉松、巴氏消毒奶、奶粉为样品，采用所建立的LAMP检测方法与中华人民共和国国家标准GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中指定的方法同时进行检测，比较两种方法的检测结果，每个样品3次重复，并设立阴、阳性对照。

2 结果与分析

2.1 LAMP检测方法特异性试验结果

对21种常见致病菌的检测结果中金黄色葡萄球菌显示阳性结果，其余均为阴性，表明本研究建立的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法具有良好的特异性。

2.2 LAMP检测方法敏感性试验结果

对102~105CFU/ml菌落数的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法敏感性试验结果如下表4所示，当金黄色葡萄球菌浓度为102CFU/ml时即可呈现阳性反应。但由于模板提取、稀释误差等原因，灵敏度数量级可能为103CFU/mL，因此，认定该方法对金黄色葡萄球菌菌液检测的最低检出浓度为102~103CFU/ml。

表3 特异性试验结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

表4 敏感性试验结果

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性；“-(+/-)”代表阴阳性结果均会出现，判定阴性。

2.3 与国标检测方法的符合性试验结果

选择猪肉、水饺、肉松、巴士消毒奶、奶粉为样品，使用不同浓度的金黄色葡萄球菌对其进行添加，三组重复试验结果如下表5。不同样品的LAMP方法检测结果与国标方法一致，两者符合率为100%。

表5 金黄色葡萄球菌核酸检测方法与国标方法检测结果

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性。

3 讨论

（1）LAMP技术在60~65℃的恒温条件下反应30~60min即可完成基因的扩增，生成由一系列反向重复的目的基因构成的DNA片段环状混合物[13]，可有效减少繁琐的人员操作且无需昂贵的试验仪器。而选用无毒的SYBR greenI染色代替电泳，避免对操作人员的伤害和对环境的污染，且实现了样本DNA产物的可视化检测；无须DNA模板的热变性过程，使原本至少90min才能完成的扩增反应，缩减到30min，有效节约检测时间[14]。（2）本研究将LAMP方法应用于食品安全检测方面，可对食品中金黄色葡萄球菌进行定性定量检测，最低检出浓度为102~103CFU/ml，灵敏度和特异性较好。但LAMP方法在应用的同时也出现了一些值得注意的方面：一是在引物设计方面，由于是在线软件进行设计，且针对较短靶序列中的6~8个区域设计4~6条引物，导致了一些扩增效率较高的其他靶位点容易被忽略[15]，如本研究中选用的是金黄色葡萄菌的femA基因，是在对金黄色葡萄菌nuc基因的前期研究基础上改良的结果；二是由于LAMP体系扩增效率极高，且产物稳定，不易降解，易发生携带污染，致使假阳性结果的出现[16]；三是LAMP体系极易被污染，开管操作应在单独操作室内进行，避免被微量污染物污染。当仅用比浊和比色法确定LAMP反应结果时，由于个体对颜色的主观感知不同，结果可能会出现偏差[17]。因此，在实际应用中，应结合配套读数仪器进行定性定量分析。

本研究根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计的特异性引物能准确结合目的基因，建立的金黄色葡萄球菌核酸检测方法，通过添加SYBR Green I染色实现结果可视化、快速高效、高灵敏度和高特异性检测，适用于各层级实验室和基层单位的普及和推广。

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（2019–10–15）

S852.61+1

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1007-1733(2019)12-0007-04