新型包埋微生物凝胶吸附、降解水中土霉素的研究

2019-12-21宋陈光

天津科技大学学报 2019年6期

曾明，潘芃，宋陈光，魏建，干宇，吴楠，王昶

(1. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457；2. 天津农学院工程技术学院，天津 300384)

土霉素(OTC)是一种典型的四环素类抗生素，由于其具有广谱活性且成本较低，作为生长促进剂被广泛应用于临床治疗和牲畜养殖业中[1]．残留的抗生素已被发现广泛存在于地表水、沉积物、土壤等环境中．残留抗生素不仅会造成化学污染，还会为抗生素耐药性的转移和传播提供选择条件[2]．

包埋技术是利用包埋剂交联微生物来制备水凝胶的技术．包埋技术作为一种固定化技术，在去除有机污染物和脱氮方面受到越来越多的关注[3-4]．相比于传统的活性污泥法，微生物包埋法可以提高废水处理效率．包埋剂包括聚乙烯醇、聚丙烯酸、卡拉胶、海藻酸钠、海藻酸钙等[5]．庞胜华等[6]研究发现包埋微生物对有机负荷有一定的冲击抵抗能力，但内部传质阻力较大，影响氧的扩散．β-环糊精(β-CD)是由7 个葡萄糖残基以α-1，4-糖苷键连接而成的环状化合物，具有亲水的外围及疏水的内腔，在溶液中可与多种有机物(如各类有机污染物)形成包合物[7]．由于β-CD 成本较低而且具有合适内径，被广泛应用于环境保护中，例如β-CD 的聚合物被用来去除水中的雌激素类物质[8]．Cui 等[9]发现β-CD 可以增大凝胶结构中的三维网格，使交联点分布较均匀，从而赋予凝胶良好的机械性能．Alsbaiee 等[10]合成了一种β-CD 的聚合物，能够快速吸附水体中的多种有机微污染物，吸附速率是活性炭的15～200 倍，并且吸附上去的污染物可以被化学性质温和的淋洗剂洗脱，从而使聚合物可以被多次再生．针对凝胶存在较大传质阻力的问题，本团队研究[11]发现，β-CD 能够增大微生物的生物活性，促进营养物质向凝胶内部的传质，从而提高同步硝化反硝化的脱氮效率．

本文在传统包埋微生物凝胶中加入β-CD 来制作新型包埋材料，对比研究它对水中OTC 的吸附和生物降解行为，并考察其微生物活性和群落多样性．

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

聚乙烯醇(PVA，水解度大于97% )、海藻酸钠(SA)、β-CD、NaNO3、CaCl2以及配制模拟废水(每升模拟废水中含有200 mg 蔗糖，2 mg OTC，100 mg NH4Cl，27 mg KH2PO4，500 mg NaHCO3，180 mg CaCl2·2H2O，300 mg MgSO4·7H2O 和1 mL 微量元素液(625 mg/L EDTA，190 mg/L NiCl2·6H2O，430 mg/L ZnSO4·7H2O ，220 mg/L NaMoO4·2H2O ，240 mg/L CoCl2·6H2O ，990 mg/L MnCl2·4H2O ，250 mg/L CuSO4·5H2O))的化学药品均购自天津光复精细化工研究所；OTC，赤峰制药股份有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，Sigma-Aldrich 公司；PBS 缓冲液，Solarbio公司．

Oxi3210 型溶解氧仪，德国WTW 公司；LC-20 A 型高效液相色谱仪，日本岛津公司；FSH-2A 型高速搅拌机，上海谷宁仪器有限公司．

1.2 微生物凝胶小球的制备

在90 ℃水浴加热的条件下，使固体的PVA、SA和β-CD 完全混合溶解，最终三者的质量浓度分别为PVA 70 g/L、SA10 g/L 和β-CD 20 g/L．3 500 r/min 离心10 min 得到浓缩的活性污泥(含水率约为10%). 然后将其加入到冷却至35 ℃的凝胶溶液中，使最终污泥的质量浓度(干质量)约为2 g/L．用蠕动泵以固定流速将凝胶溶液缓慢滴加到质量浓度为500 g/L NaNO3和20 g/L CaCl2的交联液中，制成粒径(3.5±0.3)mm 的凝胶小球，在交联液中4 ℃保存12 h，最后用水清洗凝胶小球．本研究对比了有β-CD 小球和无β-CD 小球对OTC 的吸附和降解行为．

1.3 OTC吸附实验

将未包埋微生物的凝胶小球在70 ℃下烘干2 d至质量恒定，然后加入到200 mL 100 mg/L 的OTC溶液中，分别于0、1、2.5、5、10、120 min 采集水样，分析OTC 的质量浓度．通过式(1)计算扩散系数(De)，通过式(2)计算出干燥凝胶小球对OTC 的吸附量(Q)[12]．

式中：ρ0为OTC 的初始质量浓度，mg/L；ρf为OTC的最终质量浓度，mg/L；ρt为t 时刻OTC 的质量浓度，mg/L；De为扩散系数，cm2/s；d 为凝胶小球的直径，cm；V 为液体体积，mL；m 为加入的干燥凝胶小球的质量，g．

1.4 OTC降解实验

取200 g 包埋微生物的湿质量凝胶小球放入容积为6 L 的圆柱形生物反应器中，用模拟废水以0.39 L/h 的流量连续输送到反应器中进行生物降解反应．反应器启动1 个月后，水流流量依次调整为0.91、0.66、0.39 L/h，每个流量维持两周时间．之后在0.39 L/h 的流量下，依次调整蔗糖与OTC 的质量比为100∶2、50∶2 和0∶2．每天收集进水和出水，检测OTC 质量浓度和化学需氧量(COD)．

1.5 呼吸实验

在20 ℃恒温条件下，先将包埋有微生物的凝胶小球浸没在蒸馏水中，使用溶解氧仪测定氧气消耗速率，计算内源呼吸速率．获得稳定内源呼吸速率数据后，向蒸馏水中加入OTC，计算以OTC 作为唯一碳源的外源呼吸速率．最后，加入模拟废水，计算以OTC 和蔗糖共同作为碳源的外源呼吸速率．根据凝胶小球内包埋的微生物质量，可以通过式(3)得到比内源及比外源呼吸速率，以此来评估被包埋微生物的活性．包埋微生物浓度是用Chen 等[13]的方法测定小球内部微生物蛋白质的含量换算得到的．

式中：SOUR 为微生物比呼吸速率，mg/(g·h)；ρi为初始的溶解氧浓度，mg/L；ρe为最终的溶解氧浓度，mg/L；Δt 为ρi到ρe所经历的时间，h；VSS 是微生物的质量浓度，g/L．

1.6 分析方法

采用高效液相色谱(HPLC)系统和紫外检测仪检测水中OTC 浓度．C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相流量为0.8 mL/min，0.01 mol/L 的草酸溶液为流动相A，V(乙腈)∶V(甲醇)＝2∶1 的混合液为流动相B，检测波长为355 nm．

1.7 高通量测序

凝胶小球用高速搅拌机打碎混匀使微生物释放出来，污泥直接采集放入2 mL 的灭菌离心管中，用PBS 缓冲液清洗．分析前一直在-20 ℃下冷藏．微生物群落的产物纯化和高通量测序分析在北京奥维森基因科技有限公司的Illumina MiSeq 平台上操作．

2 结果与讨论

2.1 OTC的吸附

图1 为OTC 在凝胶小球内部传质性能随时间变化图，可以发现有β-CD 小球的拟合曲线斜率大于无 β-CD 小球的，有β-CD 小球的扩散系数与吸附OTC的质量分别达到了6.1×10-7cm2/s 和8.1 mg/g；而无β-CD 的凝胶小球这两组数值仅分别为4.9×10-7cm2/s和7.6 mg/g．这说明β-CD 能够一定程度地增大OTC在小球内部的扩散系数，缓解传质阻力较大的问题．除此以外，还发现β-CD 可以增加转移到凝胶小球内的OTC 的量，可能是因为它对有机物强烈的吸附能力．已有研究证明，β-CD 可以和多种有机物形成主客体包结物．例如，苯甲酸进入内部疏水的β-CD 孔隙中会被诱导形成1∶1 的轴向主客体的包结物[14]．因此推测β-CD 应该能与OTC 形成包结物．

图1 OTC在凝胶小球内部传质性能随时间变化图 Fig. 1 Transfer capacity of OTC into gel beads with timevariation

2.2 OTC的生物降解

由于凝胶对OTC 有强烈的吸附作用，而本研究使用的OTC 浓度不高，如果采用序批式实验，凝胶小球会大量吸附模拟废水中的OTC，无法研究其降解效果，因此用连续进水实验来研究OTC 的生物降解，结果见表1．

随着流量的降低，出水OTC 浓度逐渐减小．无β-CD 小球对OTC 的去除率从11%增长到33%，有β-CD 小球对 OTC 的去除率则从 18% 增长到37%．主要原因是停留时间的增大让凝胶中微生物与污染物接触时间变长，而流量较高、水力停留时间较低时，由于废水中的OTC 没有充分被吸附，也没有充分进入包埋颗粒内部，因此去除率相对较低．靖丹枫等[15]发现当固定化膜生物反应器的停留时间由6 h提高到24 h，OTC 的去除率由64%提高到75%．

另外对比有β-CD 小球和无β-CD 小球，可以看出两种凝胶小球的OTC 去除率在所有条件下都比较接近，没有较大的差异，仅蔗糖与OTC 的比例高的条件下，有β-CD 小球比无β-CD 小球的OTC 去除率略高一些．说明能够降解OTC 的微生物在这两种小球中的生长状态一致，差异不明显的原因可能是OTC 的浓度较低．但是对于COD 的生物降解而言，有β-CD 小球比无β-CD 小球的COD 去除率要高(表1)，最大能达到90%，尤其是在较高水流流量的情况下．这可能与β-CD 对微生物的保护作用有关，孔德洋等[16]研究了环糊精对硝基苯的生物降解的影响，发现环糊精可以提高降解菌对硝基苯的耐受浓度，缩短降解菌的停滞时间，促进降解菌的生长，加快硝基苯的降解．但是本研究中并没有发现β-CD 对OTC降解有明显的促进作用，或许经过长时间驯化培养后，β-CD 小球能促进OTC 的降解．

表1 不同条件下OTC和COD的去除效率总结 Tab. 1 OTC and COD removal efficiency under different operation conditions

OTC 属于难生物降解的有机物，降解机理属于共代谢，因此评估了蔗糖与OTC 质量比对OTC 去除率的影响(表1)．随着蔗糖与OTC 质量比的减小，出水OTC 的浓度增加，OTC 的去除率从42%显著降低到4%，这个结果进一步证明了共代谢对OTC 的降解起主要作用．同样的，赵联芳等[17]发现人工湿地的进水COD 浓度越高，OTC 的去除率越高，特别是当COD 浓度大于400 mg/L 时，OTC 的去除率均达到90%以上．

2.3 微生物活性

表2 汇总了活性污泥(SS)，有β-CD 和无β-CD小球中微生物的呼吸速率．

表2 活性污泥(SS)、有β-CD和无β-CD小球的比内源和最大比外源呼吸速率对比 Tab. 2 Comparison of endogenous and maximum specific exogenous respiration rates of suspended sludge(SS)and gel beads with and without β-CD

由表2 可知，包埋能显著增加微生物的呼吸速率，即微生物活性，如包埋小球的比内源呼吸速率和最大比外源呼吸速率都远大于活性污泥．可以发现，当以OTC 作为唯一碳源时，包埋小球的比内源呼吸速率和最大比外源呼吸速率差异不大，说明微生物并没有较强的能力以OTC 作为碳源进行外源呼吸作用，这与表1 中较低的OTC 去除效率一致．但是，2 mg/L 的OTC 也没能对被凝胶包埋的微生物产生强烈抑制作用，在加入蔗糖基质后，被包埋的微生物的最大比外源呼吸速率有了极大的提高，主要原因是微生物开始大量利用容易降解的碳源进行呼吸作用，这一现象与表1 中较高的COD 去除效率一致．当OTC和蔗糖质量比为2∶200 时，有β-CD 小球最大比外源呼吸速率为1.22 mg/(g·h)，无β-CD 小球的为0.61 mg/(g·h)，速率最低的是活性污泥，仅为0.07 mg/(g·h)．这说明加入β-CD 可以显著增加微生物的活性，其原因可能是β-CD 对包埋的微生物起到一些保护作用．例如，Chen 等[18]对比了含环糊精和不含环糊精的超支化聚酰胺水凝胶材料的细胞毒性，发现将环糊精通过共价键引入超支化聚酰胺降低了凝胶材料对细胞的毒性．β-CD 对于能降解OTC 的微生物的促进作用并不明显，可能是由于驯化时间较短．

2.4 微生物多样性分析

活性污泥、有β-CD 和无β-CD 小球的微生物群落多样性指数见表3．

表3 活性污泥(SS)、有β-CD和无β-CD小球的微生物群落多样性指数 Tab. 3 Diversity indexes of bacterial community in suspended sludge and gel beads with and without β-CD

活性污泥中发现的原核微生物种类最多，综合Shannon 指数和Chao1 指数，SS 的多样性指数最高，说明活性污泥的微生物群落多样性最高，其次是有β-CD 小球，而无β-CD 的凝胶小球微生物多样性最低．原因可能是经过微生物固定化技术淘汰了一些活性污泥中的微生物，因为包埋的过程中需要经历一段低温和高渗透压的条件．有β-CD 凝胶小球由于β-CD 的添加，对微生物的活性保持具有一定的促进作用[13]，因此微生物多样性相对较高．Coverage 指数表示样品的覆盖度，3 组Coverage 指数数值均在0.99以上，表明样品中序列没有被测出的概率较低．

活性污泥、无β-CD 小球和有β-CD 小球包埋的微生物门水平上的相对丰度如图2 所示．按照相对丰度由大到小的排列顺序如下：变形菌门(Proteobacteria) ＞拟杆菌门(Bacteroidetes) ＞放线菌门(Actinobacteria)＞Saccharibacteria 等．变形菌门在3种样品中都处于优势菌，包埋小球中变形菌门的数量较活性污泥有所增加，其在有β-CD 小球、无β-CD 小球和活性污泥中所占比例依次为66.30%、62.95%、48.37%．这与李帅[19]的研究结果一致，他发现在抗生素的作用下，变形菌门丰度明显上升．另外，吴颖[20]发现变形菌门和放线菌门都能够携带抗性基因．本研究发现在抗生素逆境的胁迫下，包埋小球中上述携带抗性基因的菌门数量有所增加，而其他菌门的数量有所减少(图2)．拟杆菌门也是一类常见的抗生素耐药菌[21]，本研究也发现它主要存在于无β-CD 凝胶小球中，其次是活性污泥，含量最少的是有β-CD 凝胶小球，所占比例依次为33.96%、21.92%和15.47%．

图2 活性污泥、有β-CD 和无β-CD 小球的微生物门水平的微生物相对丰度(显示丰度大于0.1‰的门) Fig. 2 Taxonomic classification of bacterial communities of suspended sludge and gel beads with and without β-CD gel beads at a phylum level(greater than 0.1‰)

为了深入研究微生物群落组成，对比了活性污泥、无β-CD 小球和有β-CD 小球包埋微生物属水平的微生物相对丰度，结果如图3 所示．

图3 活性污泥、有β-CD和无β-CD小球的微生物属水平的微生物相对丰度(显示丰度大于0.1%的属) Fig. 3 Taxonomic classification of bacterial communities of suspended sludge and gel beads with and without β-CD gel beads at a genus level(greater than 0.1%)

可以发现，3 种样品属水平的微生物各不相同，在有β-CD 小球中，棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Alicycliphilus、Flavihumibacter 和假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)含量较多，分别为16.42%、10.11%、7.21%、6.84%和6.00%．有研究[22]表明，棒状杆菌在好氧条件下具有较强的降解抗生素药物中间体的能力，废水COD 的去除率达到37.8%，与本文的40%左右的OTC 去除率一致，不动杆菌属也被报道会对常用抗生素产生耐药性[23]．无 β-CD 小球中的主要菌属为 Flavihumibacter，占比 22.53% ，其次是嗜酸菌属(Acidovorax)，占6.16%，最后是假黄单胞菌属，占6.00%；然而关于这些菌群抗生素耐药性的研究不多，作者推测这些菌群可能也具有一定的耐药性和抗生素降解性能，还需要从抗性基因方面深入研究．活性污泥中的优势菌属相对于凝胶小球则完全不同，分别为鞘脂菌属(Sphingobium)、Nakamurella、Ferruginibacter，占比依次为8.59%、8.18%和7.98%．因此，通过属水平分析可知，活性污泥被凝胶包埋后在抗生素胁迫条件下，微生物群落有了很大变化，而且β-CD 的加入也能改变凝胶小球内部的微生物群落，有β-CD 小球含有较多的抗药性微生物菌属．

总之，凝胶小球对于OTC 有较高的吸附性能，也会大大促进微生物的活性，对包埋的微生物起到保护作用．有β-CD 小球与无β-CD 小球在OTC 的降解方面基本没有差别，但是在COD 的降解方面差别比较大(表1)，推测这一现象与β-CD 包埋的凝胶小球的吸附性能和微生物活性、群落组成的特性有关．在本研究中，β-CD 主要影响的并不是降解OTC 的微生物，而是其他的异养型的微生物．