史清照，柴国璧，汪军霞，刘俊辉，范 武，毛 健，席 辉，宋瑜冰，马 骥，王 予，陶 红，周 瑢，欧阳路斯，屈 展，宗永立，张建勋，张启东*，赖燕华*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草行业香料基础研究重点实验室，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 广东中烟工业有限责任公司技术中心，广州市天河区林和西横路186 号 510385

卷烟产品香味物质的剖析始终是烟草领域的研究热点之一。由于气相色谱相关技术的发展，对低分子量、挥发性强的物质有优越的分离能力且配备完备的化合物标准谱库，卷烟香气成分分析研究较为丰富[1-4]。相比之下，因挥发性低、热稳定性弱、需要进行品尝等不利因素，大大限制了对味觉成分的研究[5-8]。

但与嗅觉相比，味觉分类简单明确，仅包括酸、甜、苦、咸、鲜5 个指标，适合于以感官为导向的方法进行分析，在食品行业，也常使用以感官导向为基础的分离技术分析味觉成分[9-11]。例如，针对豪达奶酪（Gouda cheese），利用凝胶色谱分离奶酪水提物，结合味觉稀释分析技术（Taste dilution analysis, TDA），从中定位出具有明显苦、酸、咸、鲜的味觉特征组分，进而分析得到豪达奶酪中苦味特征组分的16 种苦味肽，为该产品苦味特征的分析和调控提供了技术支持[12]。另有研究者以可可粉为研究对象，以感官导向分析法获得了可可粉中涩感、残留感、苦味、酸味等化学感觉和味觉特征组分[13]。针对牛肉汤的感官导向分离，获得了苦味、鲜味、咸味、甜味、酸味和具有强酸味及带来口干感的味觉特征组分，进而发现了一种影响牛肉汤总体口味质量，尤其是甜味和鲜味特点的味觉增强剂[14]。

酸味是5 个基本味觉指标之一，也是中式卷烟重要的风格特征，研究发现，适宜的酸味有助于增强烟气成熟感，提升烟气柔和圆润感[15-16]。目前针对卷烟主流烟气中酸味成分系统分析的报道较少，大部分研究针对烟气中总体有机酸，或根据挥发性将有机酸进行简单分类，并未对其感官贡献从嗅觉与味觉两种角度加以区分[17-19]，且相关报道所涉及的研究对象并未经过明确筛选与定位，大部分研究对象是饱和脂肪酸。而研究表明，当脂肪酸的碳原子数大于6 时，其味觉特征主要表现为脂肪味、油脂味，酸味较弱[20]。

基于以上背景，借鉴感官导向分析方法，对卷烟主流烟气粒相物进行凝胶色谱分离，定位主流烟气粒相物中酸味特征组分，并采用GC/MS 技术定性分析，剖析卷烟烟气中具有酸味特征的成分，结合测定的阈值获得酸味成分的味觉活性值（Taste activity value，TAV），评价其酸味贡献强度，并通过卷烟注射加香及评吸进一步证明特征成分对烟气的酸味贡献。通过对酸味成分的系统研究，旨在为卷烟产品酸味感官特征评价提供依据，也为卷烟产品风格的定向设计和相关质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟草添加剂安全性评估参比卷烟（上海烟草集团有限责任公司）；实验用卷烟样品为12 个市售品牌成品卷烟，包括8 种常规烤烟型卷烟、3 种低焦油烤烟型卷烟及1 种混合型卷烟。

乙醇（色谱纯，北京迪科马科技有限公司）；超纯水（10 MΩ，屈臣氏公司）；己酸（98%）、乳酸（98%）、3-甲基-2-羟基丁酸（99%）、4-甲基-2-羟基戊酸（99%）、苹果酸（99%）（美国Sigma-Aldrich 公司）；2-羟基丁酸（95%）、3-羟基丙酸（30%）、2,3-二羟基丙酸（20%）、反式-3-己烯酸（99%）（日本Tokyo Chemical Industry 公司）；丙酮（色谱纯）、吡啶（色谱纯）、2-甲基丁酸（98%）、4-戊烯酸（98%）、羟基乙酸（99%）、亚甲基丁二酸（99%）（J&K Scientific 公司）；乙酰丙酸（98%，美国Alfa-Aesar 公司）；丁二酸、丁二烯酸（99%，美国Acros Organics 公司）；N，O-双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSTFA，＞99%，美国Regis Technologies公司）。

7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪、DB-5MS 色谱柱（60 m×0.25 mm i.d. ×0.25 μm d.f.）（美国Agilent公司）；NGC Quest 10 Plus 型中高压层析系统（美国Bio-Rad 公司）；凝胶色谱柱（2.6 cm×100 cm）（瑞士Büchi 公司）；Sephadex LH-20填料（瑞典GE Healthcare公司）；SM450 20 孔道直线型吸烟机（英国Cerulean公司mm剑桥滤片（英国Whatman公司）；AL204分析天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；HY-5型振荡器（金坛中大仪器厂）；R-210 旋转蒸发仪（瑞士Büchi 公司）；Alpha 1-2 LDplus 冷冻干燥机（德国Christ 公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟气粒相物酸味特征组分的分离

依据参考文献[4]中的方法，获得主流烟气粒相物的水溶性组分。凝胶渗透色谱（GPC）分离该水溶性组分。分离条件为：流动相为蒸馏水，填料为Sephadex LH-20，流速1 mL/min，通过收集器每10 min收集一个流份，共收集40 个流份。紫外检测仪监测以确定收集流份的起点和终点。参考文献[13]中的方法，对流份进行逐级稀释及滋味评价，确定具有酸味的特征流份，合并酸味特征流份，冷冻干燥（预冻温度：-18 ℃；冷冻干燥温度：-53 ℃；冷冻干燥时间：24 h）后得到酸味特征组分。需要指出的是，滋味评价过程中，评价人员每次的样品品尝量为10 μL，低于一支卷烟的摄入量。

1.2.2 酸味特征组分的定性分析

采用BSTFA 衍生化法测定酸味特征组分[18]，衍生化反应后进行GC/MS 分析。分析条件：

进样口温度：250 ℃；进样方式：恒流模式；分流比：50∶1；进样量：1 μL；载气及流速：He（99.999%），1 mL/min；程序升温：50 ℃（1 min）280 ℃（3 min）；电离方式：电子轰击（EI）；电离能量：70 eV；溶剂延迟：0 min；传输线温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：全扫描；扫描质量数范围：33～450 amu。采用NIST11 和Wiley 谱库匹配定性。

1.2.3 酸味特征组分的定量分析

取2 张剑桥滤片，加入20 mL 含内标（反式-3-己烯酸，浓度：5 μg/mL）的丙酮溶液，室温萃取30 min，衍生化后进行GC/MS 分析[18]，每个样品测定2 次，取平均值。GC/MS 分析条件同1.2.2 节；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。待测化合物保留时间、定性及定量离子的参数选择见表1。

表1 酸味成分及内标保留时间和选择离子Tab.1 Retention times and selected ions of sour components and internal standard

1.2.4 酸味成分味觉阈值测定和味觉活性值计算

采用GB/T 22366—2008《感官分析 方法学 采用三点选配法（3-AFC）测定嗅觉、味觉和风味觉察阈值的一般导则》中最优估计阈值（Best estimate threshold, BET）法测定酸味成分的味觉阈值[21]。

以品牌卷烟中各物质质量分数与其味觉阈值的比值，作为该物质在卷烟中的TAV。以所得TAV 为依据，判定各成分对于卷烟烟气酸味的贡献。

1.2.5 酸味成分在卷烟中的作用验证

为明确酸味成分在卷烟中的作用，对参比卷烟进行酸味成分组群的加香注射，感官评价对比加香前后参比卷烟的感官特征差异。考虑到各成分在侧流烟气的损失和自身转移率的限制，所有成分的注射量均为对应成分在参比卷烟TPM中质量分数的10倍，加香溶液的溶剂为蒸馏水。

由15 位具有省级或以上资质的评吸人员组成卷烟感官评价小组。借鉴YC/T 497—2014[22]及YC/T 496—2014[23]推荐的中式卷烟风格感官评价方法和卷烟感官舒适性评价方法，从味觉风格、烟气香韵、舒适感特性、烟气特性4 个方面对卷烟进行感官评价，各指标最终评吸结果为15 位评委所给出分值的均值。

2 结果与讨论

2.1 主流烟气粒相物的GPC 感官导向分离

实现主流烟气粒相物感官特征组分分离的关键是选择合适的色谱分离材料。研究表明，感官刺激物分子和人体感觉器官表面受体产生的相互作用是感官刺激产生的关键。而各种不同的感官受体均只能与一定空间体积和结构的分子发生相互作用[24]。GPC分离是基于分子体积差异性的分离技术，因此有可能完成对相似感官特征分子的有效分离和富集[4]；同时，GPC 可用水作为流动相，有利于感官评价人员直接评价分离流份的味觉特征。因此，选择GPC 作为主流烟气粒相物的分离手段。

主流烟气粒相物水溶液所得分离流份滋味特征评价结果如图1 所示。在所得流份中出现了辣、酸和苦味3 种味觉特征。从流份6 开始，辣感和酸味同时出现，且以辣感为主，从流份8 开始，辣感逐渐减弱，酸味增加，并逐渐出现苦味。从流份11 开始，辣感和酸味消失，出现较纯粹苦味并持续至流份30。基于滋味特征评价结果，将具有明显酸味特征的8～10 流份合并，冷冻干燥后得到酸味特征组分。

图1 卷烟主流烟气粒相物分离流份滋味特征评价结果Fig.1 Results of taste characteristics of fractions separated from TPM of mainstream cigarette smoke

2.2 主流烟气粒相物中酸味成分的定性分析

酸味形成的生物学机理在于质子刺激舌黏膜引起的味感，因此酸味化合物多为有机酸[25]。分析前先采用BSTFA 为衍生化试剂将其硅烷化，使其在非极性柱上的峰形更加对称，有助于定量分析。根据定性结果（图2）及定性成分标准品的味觉特征评价，最终鉴定出卷烟主流烟气粒相物中15 种酸味成分（表2）。

图2 卷烟样品主流烟气粒相物的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of TPM of mains tream cigarette smoke of sample

另外，为进一步验证15 种酸味成分的味觉特征，将其标准品配制成两种浓度的水溶液，评价其味觉特征，结果见表2。可知，15 种成分均具有酸味；此外，8 种成分还具甜味，5 种成分有涩感，4-甲基-2-羟基戊酸的甜味和涩味特征明显，3-甲基-2-羟基丁酸和亚甲基丁二酸的涩感特征明显。

2.3 主流烟气粒相物中酸味成分的定量分析

用选择离子扫描的方式对TPM中的酸味成分进行定量，标准工作溶液及卷烟样品的选择离子扫描图如图3 所示。12 种不同品牌卷烟主流烟气粒相物中酸味成分质量分数的测定结果见表3。

总体来看，乙酸、乳酸两种酸味成分在各品牌卷烟主流烟气粒相物中的质量分数明显高于其他13种酸味成分；另外，不同品牌卷烟间乳酸在主流烟气粒相物中的质量分数差异较大，如6 号卷烟几乎是其他常规烤烟型卷烟的2～3 倍，这说明乳酸质量分数的差异可能是人为调控的，而同类型、不同品牌卷烟主流烟气粒相物间乙酸质量分数的差异并不明显。除此之外，3 种低焦油卷烟主流烟气粒相物中乙酸

质量分数低于常规烤烟型及混合型卷烟，所测混合型卷烟主流烟气粒相物乳酸质量分数低于其他类型的卷烟。

表2 15 种酸味成分及其两种浓度水溶液中的味觉特征评价结果Tab.2 Results of taste characteristics of 15 sour components and their aqueous solutions at two concentrations

图3 标准工作溶液及卷烟样品的选择离子扫描（SIM）图Fig.3 Selected ion scan spectra of standard working solution and cigarette sample

除乙酸和乳酸外，羟基乙酸主流烟气粒相物中的质量分数也较高，不同品牌卷烟主流烟气粒相物中羟基乙酸质量分数的差异不大；与乳酸类似，混合型卷烟主流烟气粒相物中羟基乙酸的质量分数也略低于其他两种类型的卷烟。此外，由表2 的味觉评价结果可知，乳酸及羟基乙酸除具有酸味外，还有甜味，因此这些化合物在影响卷烟酸味的同时，也极有可能对其甜味造成影响。

此外，3-羟基丙酸、乙酰丙酸、2,3-二羟基丙酸等化合物质量分数处于相对较高水平，在品牌间及不同类型卷烟间的质量分数差异不大。丁二烯酸的质量分数也相对较高，但在低焦油卷烟主流烟气粒相物中的质量分数明显低于常规烤烟型和混合型卷烟。2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、3-甲基-2-羟基丁酸、4-甲基-2-羟基戊酸、亚甲基丁二酸具有涩感的成分在粒相物中的质量分数较低，且品牌间的差异不明显。

2.4 酸味成分的感官贡献分析

仅以不同酸味成分在主流烟气粒相物中的质量分数高低并不能判断其对酸味贡献的差异，因此，测定了15 种酸味成分的味觉阈值，结果见表4。结合各成分在12 种品牌卷烟主流烟气粒相物中的质量分数分布，计算得到对应的TAV（表5），以TAV 的大小衡量15 种成分对酸味的贡献[20,26-27]。

在15 种酸味成分中，乙酸和乳酸对酸味贡献较高，TAV 均远高于其他13 种化合物，这是因为两者的味觉阈值相对较低且质量分数较其他13 种酸味成分高。将各品牌卷烟15 种酸味成分的TAV 之和、乙酸与乳酸的TAV 之和对比（图4）发现两者具有相同的变化趋势，因此可以认为乙酸与乳酸的TAV 之和能够在很大程度上表征酸味成分组群对卷烟总体酸味感受的影响。

常见的研究报道中，常常将乙酸的嗅觉与味觉感受不加区分[17-19]。本研究中除了乙酸的味觉阈值外，还测定了其在乙醇中的嗅觉阈值（Oder activity value，OAV），见表4。通过计算可知乙酸的OAV 约为其TAV的2.5 倍，说明虽然乙酸是一种重要的酸味物质，但其感官贡献以嗅觉（酸香）为主。另外，乳酸的TAV 也较高，不同品牌间乳酸的质量分数差异较大，其TAV 也显示出了较大的差异，6 号卷烟乳酸的TAV 几乎是其他卷烟乳酸TAV 的2～3 倍。

除乙酸和乳酸外，羟基乙酸质量分数相对较高，其TAV 也相对较高。丁二酸的阈值在15 种酸味成分中最低，但粒相物中丁二酸的质量分数并不高，所以其TAV低于乙酸和乳酸。丁二烯酸在常规烤烟型及混合型卷烟主流烟气粒相物中的TAV 也较高，但在低焦油卷烟主流烟气粒相物中的质量分数偏低，导致其在低焦油卷烟中的TAV 相对较低。基于表2中的感官评价结果，乳酸、羟基乙酸及丁二酸除具有酸味外，还具有甜味感受，且其TAV 值均相对较高，因此这些化合物影响卷烟酸味感受的同时，对甜味感受也会有较大的影响。

在带有涩感的化合物中，除了2-羟基丁酸的TAV稍高，2-甲基丁酸、3-甲基-2-羟基丁酸、4-甲基-2-羟基戊酸、亚甲基丁二酸的TAV均处于较低水平，因而与甜味相比，对卷烟涩感的影响不大。

将各品牌卷烟15 种酸味成分的TAV 加和，表征其对卷烟酸味的总体贡献，结果见表5。以化合物在单支卷烟的TAV 加和计算，常规烤烟型卷烟的单支卷烟酸味强度要高于低焦油和混合型卷烟，而从化合物在主流烟气粒相物中的TAV 加和来看，低焦油与常规烤烟型卷烟的酸味强度差异不大，但混合型卷烟的酸味强度较低，这与常规烤烟型和混合型卷烟抽吸的感官特征差异性一致。虽然低焦油卷烟的焦油量降低，但其酸味强度与常规烤烟型卷烟仍保持在同一水平，符合二者的抽吸感受。

综上分析可知，与基于经验筛选研究对象进而通过TAV 定位关键物质的研究思路不同，本研究中以TPM 为起始研究对象，感官导向分离其中的酸味流份，进而从酸味流份中定位得到了15种酸味成分，获得了脂肪酸、羟基酸、烯酸等多种对卷烟酸味贡献强度各异的化合物，且大部分化合物除了主要的酸味外，还具有甜味、涩感等。

表4 15 种酸味成分的阈值Tab.4 Threshold values of 15 sour components(μg·g-1)

2.5 酸味成分的加香评吸结果

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图4 12 种卷烟样品主流烟气粒相物中15 种酸味成分TAV 之和及乙酸和乳酸的TAV 之和Fig.4 Sum of TAVs of 15 sour components and that of acetic acid and lactic acid in mainstream cigarette smoke of 12 samples

图5 空白卷烟（蓝色）和添加酸味成分的卷烟（红色）的感官特征对比Fig.5 Comparison of sensory characteristics between blank cigarette（blue）and cigarettes added with sour components（red）

空白卷烟和添加酸味成分的卷烟的味觉风格、烟气香韵、舒适感和烟气特性对比如图5 所示。可以看出，添加了酸味成分组群的卷烟酸味口感明显提升，进一步说明本研究中定位的15 种酸味成分具有有效的酸味调节作用，是卷烟重要的酸味成分；除此之外，卷烟的甜味口感也有所提升，符合部分酸味成分兼具甜味的感官感受。加入酸味成分后，烟气的甜香、果香明显增强，其余香韵基本不变；同时明显降低了烟气的刺激和杂气，改善了余味，提高了烟气的细腻程度。

3 结论

利用凝胶色谱分离技术对卷烟主流烟气总粒相物进行了流份分离，在感官导向下定位了酸味组分，并利用GC/MS 技术鉴定了15 种酸味物质：①TAV 显示15 种酸味成分均对卷烟味觉有贡献，乙酸和乳酸对酸味的贡献最大；不同卷烟品牌间乳酸的TAV 差异较大，人为调控因素较高；②部分酸味成分具有甜味及涩感表现；③评吸结果显示，施加酸味成分能够降低卷烟刺激性、改善余味，明显提高卷烟的酸味口感、甜香香韵及甜味口感。