潘虹，陈蓓丽，李腾龑，马旭*

(1.北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081；3.安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心，合肥 230022)

卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)又称为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，是一种严重影响女性生殖健康的疾病，临床表现为40岁以前停经并伴随血浆促性腺激素水平增加[1]。其可能的病理机制包括原始卵泡池的初始减少或原始卵泡未能成熟[2]。多种因素可导致POI的发生，然而，大多数POI病例被认为是特发性的，可能与遗传因素相关。目前，经过大量工作已经鉴定若干非综合征型POI相关基因，如FSHR、LHCGR、NR5A1、NOBOX、FOXL2、FIGLA、BMP15、NANOS3、STAG3、ADAMTS19和BMPR2，极大促进了我们对POI发病机制的了解[3]。

微小RNA(miRNA)参与卵母细胞成熟和卵泡发生的过程，其表达改变可能影响POI的发生[4-5]。MIR449B(miR-449b)是miR-449簇的成员，具有强烈的组织表达特异性，在睾丸和卵巢中具有较高水平[6]。目前，已经鉴定了许多miR-449b靶基因，例如SIRT1、CCNE2、MET、GMNN、HDAC1、CDK4、CDC25A和CDK6，在多种生物学过程中发挥重要作用[7]。Rs10061133 A>G是miR-449b成熟区(hsa-miR-449b-5p)一个高度保守的多态性位点，为研究该多态性位点与POI发病的相关性，我们之前通过质谱的方法对miR-449b rs10061133多态位点进行基因分型，关联分析结果显示rs10061133 AA基因型携带者患POI的风险高[8]。但目前尚不清楚miR-449b参与POI的具体机制，本研究拟通过预测鉴定其与POI相关下游靶基因，了解其参与POI的可能作用方式。

资料与方法

一、预测miR-449b的潜在靶基因

miRWalk(http：∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)在线预测miR-449b的潜在靶基因[9]。TargetScanHuman 7.2(http：∥www.targetscan.org/vert_72/)用于预测miR-449b的结合位点。文献检索这些潜在靶基因与POI发生发展的相关性，找到可能与POI相关的miR-449b潜在靶基因。

二、质粒构建和定点突变

对照载体、miR-449b(rs10061133 AA基因型)、miRNA抑制剂对照和miR-449b抑制剂购自GeneCopoeia(Rockville，Maryland，美国)。以……