张 涛，张涛涛，吴旺宇，耿 浩，刘 杰，王 弦，万 阳，张志华，马嘉兴，方 露，钱伟伟，李恩来，张志辉，于德新

肾癌是泌尿系统常见的恶性程度较高的肿瘤，发病原因复杂多样[1]。吸烟是肾癌最为明确的危险因素，不仅可以增加肾癌的发生率，而且会影响肿瘤的分期[2]。高强度、长时间的吸烟会增加罹患进展期肾癌的可能性，并对患者预后产生不利影响[3]，但目前具体分子机制尚不明确。本研究主要探讨吸烟对于肾脏透明细胞癌患者的肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的诱导作用，尝试从EMT的角度揭示吸烟促进肾癌发展演变的机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准。选取了2017年12月～2019年2月于安徽医科大学第二附属医院确诊并于泌尿外科行手术治疗的肾透明细胞癌患者60例，吸烟患者(吸烟组)和非吸烟患者(非吸烟组)各30例。所有患者手术前没有进行新辅助靶向治疗或介入治疗，术前仔细询问患者的吸烟状态，如为吸烟患者，则需记录吸烟时间、吸烟量、是否戒烟和戒烟时间，并且规定戒烟<1年的患者归入未戒烟组。手术标本离体后，立即留取癌组织和部分正常肾组织，送-80 ℃ 冰箱冻存。

1.2 主要试剂鼠抗E-cadherin、鼠抗N-cadherin和兔抗vimentin抗体工作液、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司；蛋白免疫印迹试验所用抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗vimentin、抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国Proteintech公司，稀释比列1 ∶1 500；抗兔二抗购自南京巴傲德生物公司，稀释比例1 ∶10 000。

1.3 试验方法

1.3.1免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC) 选取60例患者的蜡块，切片，常规方法脱腊、水化、抗原修复、滴加过氧化氢，放置室温10 min，PBS冲洗, 滴加适量EMT标志性蛋白抗体试剂,37 ℃下孵育60 min, 冲洗去抗体, 滴加合适剂量的二抗，置于室温20 min，冲洗去二抗，加入DAB显色液染色，观察染色程度，至合适深度后迅速用蒸馏水冲洗，结束染色，最后苏木精复染后封片。切片染色结果由两位高年资病理科医师分别进行判读，当判读结果不一致时，则请第三位病理科医师进行判读并做最终的判定。染色评估使用半定量计数法[4]:光镜100倍下判断组织染色强度(0：无染色；1：低等强度染色；2：中等强度染色；3：强染色)，然后在400倍下判断染色范围(0：<5%；1：5%～25%；2：26%～75%；3：>75%)。 把强度得分和范围得分相加得出最终免疫组化评分(0～6分)。

1.3.2蛋白免疫印迹试验(Western blot) 肾癌组织在RIPA缓冲液中置于组织研磨仪上裂解，BCA法测定总蛋白浓度。质量相等的蛋白提取物经SDS-PAGE凝胶电泳然后转移到硝化纤维素膜上进行蛋白印记分析。其中以GAPDH作为内参。

2 结果

2.1 患者人口学资料共收集60例患者人口学资料，其中吸烟组和非吸烟组各30例。根据美国癌症联合会(American joint committee on cancer,AJCC)2010年肾癌分期标准，对肿瘤进行分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。根据患者病理结果对肿瘤进行分级，将Fuhrman和WHO/ISUP分级的1、2级统一为高分化，两者分级的3级统一为中分化， 两者分级的4级统一为低分化。吸烟组患者的肿瘤最大径大于非吸烟组，且吸烟组肿瘤分期中Ⅳ期患者和肿瘤低分化患者都较非吸烟组多，吸烟组肿瘤分期的I期患者和肿瘤高分化患者都较非吸烟组少，但肿瘤分期和肿瘤分化的差异均无统计学意义，见表1。患者吸烟情况见表2。

2.2 E-cadherin、N-cadherin和vimentin在吸烟组和非吸烟组肾透明细胞癌组织中的表达水平比较在肿瘤组织中，Western blot检测发现，吸烟组较非吸烟组E-cadherin表达下降(P<0.05)，而vimentin表达升高(P<0.05)。吸烟组较非吸烟组N-cadherin表达有上调，但差异无统计学意义，见图1。为了进一步检测E-cadherin、N-cadherin和vimentin在肾透明细胞癌组织中的表达，使用IHC方法检测三种蛋白的表达情况，见图2。观察结果表明E-cadherin和N-cadherin染色于细胞膜着色较深，而vimentin于细胞质中着色较深。E-cadherin在非吸烟组肾癌组织中高表达，在吸烟组肾癌组织中低表达；N-cadherin和vimentin在非吸烟组肾癌组织中低表达，在吸烟组肾癌组织中高表达。吸烟组和非吸烟组患者的E-cadherin的IHC评分比较，吸烟组表达下调，但差异无统计学意义(P=0.06)。而吸烟组和非吸烟组患者N-cadherin的IHC评分表达差异无统计学意义。吸烟组和非吸烟组患者vimentin的IHC评分比较，吸烟组较非吸烟组表达升高(P<0.01)，见图3。

表1 两组肾癌患者人口学资料

注：*将Ⅲ期和Ⅳ期肾癌患者合并进行统计分析；#将中分化和低分化肾癌患者合并进行统计分析

表2 两组肾癌患者的吸烟情况

注：累计吸烟暴露(包-年)= 吸烟时间(年)×吸烟量(包/天)

图1 Western blot方法检测 非吸烟组和吸烟组肾透明细胞癌患者肿瘤组织 E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表达水平

A：Western blot检测蛋白表达结果；B: E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白相对表达量；与非吸烟组比较:*P<0.05

2.3 吸烟状态与E-cadherin、N-cadherin及vimentin的Western blot检测结果的关系吸烟组患者中，吸烟<20包-年与吸烟>20包-年患者分别为13例和17例，戒烟>10年和戒烟<10年者分别为9例和21例。与吸烟<20包-年组患者相比，吸烟>20包-年组患者肾透明细胞癌组织中vimentin表达升高(P<0.05)，然而E-cadherin以及N-cadherin表达差异无统计学意义。与戒烟>10年组患者比较，戒烟<10年组患者肾癌组织中E-cadherin、N-cadherin 以及vimentin表达差异均无统计学意义，见图4A、B。

2.4 吸烟状态与E-cadherin、N-cadherin 和vimentin的IHC评分的关系与吸烟<20包-年组患者相比，吸烟>20包-年组的吸烟暴露时间较长的患者肾癌组织中vimentin的IHC评分升高(P<0.05)，而E-cadherin和N-cadherin的IHC评分差异均无统计学意义。与戒烟>10年组患者相比，戒烟<10年组的吸烟患者肾癌组织中E-cadherin、N-cadherin以及vimentin的IHC评分差异无统计学意义。见图4C、D。

3 讨论

肾癌的发病率逐年上升[1]，吸烟被认为是其发生发展最重要的危险因素[5-6]。吸烟危害极大，烟草成分中含有多种致癌物，它们的燃烧产物可通过各种机制攻击细胞，从而呈网络状激活各条肿瘤相关的信号通路，导致肿瘤快速发生发展的结局[7]。但现有研究中，吸烟促进肾癌发展演变的研究多集中于流行病学领域。Kroeger et al[3]对802例肾癌患者随访长达232个月，随后发现与不吸烟组比较，吸烟组肾癌患者具有相对更高的肿瘤分级，该组患者发生淋巴结转移和远处转移的风险更大，更重要的是，研究显示吸烟组患者的总生存时间和肿瘤特异性生存时间均较非吸烟组缩短，提示了吸烟对于肾癌可能存在的促进效应。虽有多位学者已经探明吸烟与肾癌进展存在关联性，但吸烟促进肾癌进展的具体分子机制仍然没有明确。

图2 免疫组织化学方法检测非吸烟组和吸烟组肾透明细胞癌患者肿瘤组织E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白染色 ×400

图3 免疫组织化学方法检测 非吸烟组和吸烟组肾透明细胞癌患者肿瘤组织 E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白染色评分与非吸烟组比较：**P<0.01

EMT是首先发现于胚胎生长中的独特生理过程。后来有研究[8]显示EMT表型变化与上皮细胞转变，获得类似间质细胞运动和侵袭能力有关。有研究者在人正常膀胱上皮细胞和小鼠模型中均证实，上皮细胞发生EMT后会导致其细胞形态变化、增殖和侵袭能力显著增强[9-11]。而蔡重阳 等[12]在人胰腺癌组织中研究发现，EMT与胰腺癌的侵袭转移关系密切，胰腺癌组织中间质标志物表达升高，而上皮标志物的表达下降，并且二种标志物的表达水平与胰腺癌的分化程度、TNM 分期以及淋巴结转移状态等临床病理参数密切相关。近期有研究报告提出，EMT与肿瘤的干细胞特性密切相关。Giordano et al[13]研究表明，EMT的诱导因子不仅诱导乳腺癌细胞EMT的发生，还会使癌细胞的干细胞特性得以增强。EMT在肿瘤的发生、转移中发挥着不可或缺的作用，调控EMT可能成为今后治疗癌症复发转移的新策略[14]。

在前期的体外细胞试验中，研究发现在人肾癌细胞系ACHN和A498中，香烟悬液可以诱导肾癌细胞发生EMT，使肾癌细胞的形态、侵袭能力和EMT标志物的表达情况都发生了转变，而且发现ERK5可以通过调控下游转录因子c-jun和c-fos促进肾癌细胞EMT进程[15]。而在本研究中，发现吸烟组肾癌患者较非吸烟组患者的肿瘤直径、肿瘤分期和肿瘤分级虽略有升高，但无统计学差异。同时在Western blot和IHC检测中均发现，吸烟组较非吸烟组患者EMT相关蛋白的表达发生了变化，结合体外细胞实验结果，认为吸烟可以诱导肾癌细胞发生EMT，而EMT在吸烟诱导肾癌进展过程中可能发挥重要作用，但具体调控机制仍待进一步研究。同时vimentin的表达与吸烟总暴露量有相关性，说明总的吸烟暴露量是肾癌细胞发生EMT的重要影响因素。研究还显示吸烟患者中，戒烟>10年组患者和<10年组患者的EMT相关蛋白表达差异无统计学意义，说明吸烟对于肾癌组织发生EMT的诱导效应是长期存在的，短期戒烟对于EMT的发生可能无影响，而长期戒烟对于肾癌EMT的影响，因病例数量有限，研究尚难以深入开展。

图4 吸烟状态与肾透明细胞癌患者肿瘤组织E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表达的关系与吸烟组比较：*P<0.05

本研究属于单中心的回顾性研究，收集的临床病例数量有限，未进行长时间的患者随访，缺乏肿瘤特异性生存期及总生存期等随访数据，但本研究使吸烟与EMT的关系在临床病例上得以呈现，并且初步的研究结果已经揭示了吸烟对肾癌组织EMT的诱导作用，与前期的体外细胞实验基本吻合。