程琢玉，严尚学，魏 伟

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以滑膜增生、血管翳形成为特征的自身免疫性疾病。新生血管形成是RA发展过程中的早期事件[1]。新生血管为关节滑膜细胞提供营养和氧气[2]，招募细胞炎症因子，引起滑膜组织的增生，形成血管翳，致关节畸形。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是重要的促炎介质，在RA过程中发挥着重要的作用[3]。Ang Ⅱ可以通过Ang Ⅱ-AT1R-ERK1/2信号通路加强佐剂性关节炎(CIA)大鼠血管损伤[4]。

新药芍药苷-6′-O-苯磺酰酯(代号CP-25)是芍药苷的新型衍生物，具有良好的抗炎免疫调节活性。研究[5]表明，CP-25可以减轻CIA小鼠关节滑膜炎性细胞浸润、滑膜增生以及滑膜炎症，血管翳形成，提示CP-25可有效抑制大鼠新生血管形成。本实验拟以人脐带静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)为对象，观察CP-25体外对其功能的影响及其相关作用机制，为进一步了解RA的病理机制及发现新的作用靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器Ang Ⅱ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Matrigel基质胶(美国Sigma公司)；8 μm Transwell小室(美国Corning公司)；兔来源抗人AngⅡ 1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)单克隆抗体(美国Abcam公司，批号：ab9391)；p-ERK1/2抗体(美国CST公司，批号：8544)；p-IκBα抗体(美国CST公司，批号：4025)；G蛋白偶联受体激酶2 (G-protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)抗体(美国CST公司，批号：3982S)；β-actin抗体(北京博奥森生物有限公司，批号：bs-0061R)；HUVEC由安徽医科大学基础医学院朱华庆教授课题组惠赠；芍药苷-6′-O-苯磺酰酯(代号CP-25)由安徽医科大学临床药理研究所合成。

1.2 方法

1.2.1HUVEC的培养 铺路石样的HUVEC长至培养瓶的90%单层，此时传代。倾弃培养基，用无菌的PBS溶液洗2～3次，加入1 ml消化液。在显微镜下观察，待细胞变圆，倒去消化液并加入含10%胎牛血清DMEM培养液终止反应。用一次性吸管将细胞吹打下来，取一半细胞液传至另一无菌培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2CCK8法检测细胞的增殖 课题组前期实验表明，TNF-α刺激HUVEC增殖的亚适浓度为5 ng/ml，作用最强在24 h；Ang Ⅱ(1×10-9、 1×10-8、 1×10-7、 1×10-6mol/L)刺激HUVEC均可使细胞数目显著增高，最适浓度为10-7mol/L，作用最强在24 h。TNF-α(5 ng/ml)和Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)联合使用可促进HUVEC增殖功能[6]。HUVEC消化后，以1.5×104细胞/孔种到96孔板中。分别设对照组、TNF-α+Ang Ⅱ组、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)组作用24 h，终止培养前每孔加入10 μl CCK8试剂室温下震荡30 s混匀后继续培养1～3 h。肉眼观察细胞孔中颜色由黄色变成深橙色，于酶标仪中读取波长450 nm处的吸光度值(A)，结果以3个复孔的均值表示。

1.2.3transwell小室法检测细胞的迁移 预先用对照组、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、 1×10-5mol/L) 处理24 h的HUVEC，用胰酶消化后制备成1×105/ml的细胞悬液，取100 μl加入无菌的8 μm的transwell小室上室，下室加入含20% FBS的培养液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。第2天取出小室，用棉签轻轻擦去内面未迁移的细胞，下室已迁移的细胞用20%甲醇配制的结晶紫室温下染色10 min。显微镜检迁移细胞数，4倍镜视野统计细胞数目。

1.2.4HUVEC的成管实验 Matrigel基质胶溶解后4 ℃环境下取55 μl包被于96孔板中，室温平衡30 min，37 ℃凝胶60 min。预先对照组、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)处理24 h的HUVEC，胰酶消化，用2% FBS的DMEM培养液制备细胞悬液。以1×104个细胞/孔的密度种到Matrigel胶上，将96孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育6 h后每隔2 h在显微镜下观察细胞的成管状况并拍照。4倍显微镜下统计成管数目。

1.3 Western blot检测HUVEC相关蛋白的表达HUVEC加入6孔板中培养至90%时，分别加入TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)培养24 h。弃去培养液后加入100 μl裂解液于冰上裂解30 min后，收集蛋白，预处理后，每孔30 μg蛋白加入10% SDS-PAGE凝胶电泳孔中电泳、转膜。室温封闭后，加入抗AT1R抗体、抗GRK2抗体、抗p-ERK抗体、抗p-IκBα抗体或β-actin抗体4 ℃过夜。辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h后。采用凝胶成像系统扫描结果后，Image J软件分析以目的蛋白条带在相同面积下的灰度值为有效值，反映蛋白表达水平。

2 结果

2.1 CP-25对Ang Ⅱ和TNF-α联合诱导的HUVEC增殖功能的影响与对照组(1.06±0.10)相比,Ang Ⅱ+TNF-α组给药作用于HUVEC 24 h后，可以促进HUVEC增殖功能(1.50±0.11)，差异有统计学意义(F=6.74，P<0.05)。与Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)+TNF-α(5 ng/ml)组相比，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)组作用24 h，细胞增殖反应无明显影响(P>0.05)。见图1。

图1 CP-25对Ang Ⅱ和TNF-α诱导的HUVEC增殖的影响

A：正常组；B：Ang Ⅱ+TNF-α组；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)组；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)组；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)组；与正常组比较:*P<0.05

2.2 CP-25对Ang Ⅱ和TNF-α 联合诱导的HUVEC迁移功能的影响与正常组比较(67.36±32.15)，Ang Ⅱ+TNF-α组给药作用于HUVEC 24 h后，可以促进HUVEC迁移功能(190.00±11.50)，差异有统计学意义(F=34.06，P<0.01)；与Ang Ⅱ+TNF-α组比较，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)组给药作用24 h可抑制其诱导的HUVEC的迁移能力，与Ang Ⅱ+TNF-α组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且不同浓度间的CP-25的抑制迁移作用没有显著性差异(P>0.05)。见图2。

2.3 CP-25对Ang Ⅱ和TNF-α 联合诱导的HUVEC成管功能的影响与正常组比较，Ang Ⅱ+TNF-α组给药作用于HUVEC 24 h后，可以促进HUVEC成管功能(367.90±48.19)，差异有统计学意义(F=31.24，P<0.01)；与Ang Ⅱ+TNF-α组比较，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)组给药作用24 h可抑制其诱导的HUVEC的成管能力(P<0.05，P<0.01)，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6mol/L)抑制成管作用最强(P<0.01)。见图3。

2.4 CP-25对Ang Ⅱ和TNF-α 联合诱导的HUVEC相关信号蛋白表达的影响与Ang Ⅱ+TNF-α组比较，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)组给药可以降低AT1R蛋白(F=4.11，P<0.05，P<0.01)、GRK2蛋白(F=14.00，P<0.05，P<0.01)表达水平。TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6mol/L)组给药明显降低HUVEC内Ang Ⅱ+TNF-α组给药诱导活化的p-ERK1/2蛋白(F=13.53，P<0.05，P<0.01)的表达水平，而TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6、1×10-5mol/L)组给药降低HUVEC内Ang Ⅱ+TNF-α组给药诱导活化的p-IκBα蛋白(F=8.61，P<0.05，P<0.01)的表达水平，见图4。

图2 CP-25 对Ang Ⅱ和TNF-α诱导的HUVEC迁移的影响×40

A：正常组；B：Ang Ⅱ+TNF-α组；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)组；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)组；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)组；与正常组比较：**P<0.01；与Ang Ⅱ+TNF-α组比较：#P<0.05

图3 CP-25 对Ang Ⅱ和TNF-α诱导的HUVEC成管的影响×40

A：正常组；B：Ang Ⅱ+TNF-α组；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)组；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)组；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)组；与正常组比较：**P<0.01；与Ang Ⅱ+TNF-α组比较：#P<0.05,##P<0.01

图4 CP-25对Ang Ⅱ与TNF-α联合刺激的HUVEC细胞 AT1R、GRK2、p-ERK、p-IκBα表达的影响

A：Ang Ⅱ+TNF-α组；B：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)组；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)组；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)组；与Ang Ⅱ+TNF-α组比较：▼P<0.05,▼▼P<0.01

3 讨论

新生血管生成是由原有的血管形成新的毛细血管，随着对氧气和营养物质需求的增加，它在缺血/缺氧组织中更为常见。生理性血管生成在胚胎发育、创面愈合等过程中起着不可缺少的作用，但是不受控制的病理性血管生成在RA滑膜炎中发挥了重要作用。在炎症早期阶段，RA患者关节滑膜内分泌大量TNF-α、前列腺素E、IL-1等促血管因子，激活内皮细胞促进其增殖迁移，形成新生微血管[7]。这些新血管为肥厚关节滑膜细胞提供营养和氧气[2]，并招募细胞因子和炎症因子浸润滑膜，引起滑膜组织的增生，这种恶性循环最终形成血管翳，引起滑膜炎症以及骨和软骨的破坏，最终导致关节畸形及功能障碍。在RA血管生成和血管翳形成过程中，血管内衬的血管内皮细胞是各种细胞因子发挥作用的重要靶点，例如血管生成介质、生长因子、渗透因子、基质降解酶等作用因子[8]。这些因子作用于内皮细胞，导致内皮基底膜和滑膜细胞外基质的降解，最终促进血管翳的形成[9]。由于滑膜血管翳内的内皮细胞难以分离出来作为研究对象，本实验选取HUVEC作为替代研究对象，观察了CP-25对其增殖、迁移以及体外成管的作用。研究[10-11]表明，Ang Ⅱ及TNF-α都参与了RA疾病的病理进程。而且在课题组前期预实验发现，Ang Ⅱ刺激HUVEC增殖的最适浓度是10-7mol/L，TNF-α刺激HUVEC增殖的适宜浓度是5 ng/ml。本实验结果显示，经Ang Ⅱ(10-7mol /L)和TNF-α(5 ng/ml) 联合刺激后HUVEC的增殖、迁移与成管能力显著增强，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)体外给药可明显抑制TNF-α和Ang Ⅱ联合诱导的HUVEC迁移与成管反应，但对其增殖作用无显著影响。

白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是临床治疗RA的主要药物，以其主要生物活性成分芍药苷结构修饰改造合成的新药芍药苷-6′-O-苯磺酰酯(代号CP-25)具有良好的抗炎免疫调节活性。研究表明，CP-25可以减轻CIA小鼠关节滑膜炎性细胞浸润、滑膜增生以及滑膜炎症，抑制淋巴细胞活化，下调白介素2(IL-2)和白介素17(IL-17)的水平，改善脾脏病理变化[5]；CP-25还可抑制人的活化B细胞的功能[12]，通过调节炎症和骨损伤的免疫介质来预防自身免疫性关节炎[13]。

由于ERK信号通路通过激活细胞核转录因子(NF-κB)调节细胞因子水平与细胞增殖、迁移紧密相关，因此检测AngⅡ和TNF-α联合使用以及CP-25 (1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)对HUVEC p-ERK、p-IκBα 等蛋白的表达变化。结果显示，与Ang Ⅱ和TNF-α联合给药组相比，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)体外给药可显著降低HUVEC的GRK2蛋白表达水平，明显降低AT1R、p-ERK和p-Ikβα的蛋白表达。AT1R为G蛋白偶联受体(GPCRs)，可被G蛋白偶联受体激酶2(GRK 2)调控。GRK 2属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族(GRKs)成员，可以磷酸化受体蛋白，参与受体的内吞和脱敏过程。它的异常表达与多种炎症疾病有关。本实验提示CP-25可能通过减弱GRK 2的表达从而调控ERK1/2-NF-κB来抑制RA的发生。