钱成炜，戴永铮，蒋 勇

Kv3.4是位于细胞膜上的电压门控钾通道，属于Shaker型钾通道蛋白。以前的研究[1-2]表明，Kv3.4在头颈部鳞状细胞癌中高表达。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins，MMPs)的主要功能是降解细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡。基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)可以水解肿瘤细胞外基质并调节细胞黏附，这与肿瘤侵袭密切相关[3]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的蛋白之一，是凋亡的主要执行者。它的激活表明细胞凋亡已进入不可逆转的阶段[4]。尽管研究[5]表明Kv3.4在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)中高表达，但其与OSCC发展和特定分子机制的关联仍有待进一步研究。基于此，本研究假设Kv3.4与肿瘤的侵袭、增殖和凋亡密切相关，并推测Kv3.4通过调节细胞周期，干扰MMP-9表达和激活Caspase-3来实现上述功能。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂血清购自以色列Biological Industries公司；青霉素-抗生素、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA试剂盒、cyclin D1一抗、cyclin E1一抗、caspase-3一抗、细胞周期试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司；DMEM购自美国Hyclone公司；共聚焦培养皿、Transwell小室购自美国Corning公司；siRNA-KCNC4、siRNA-NC购自上海吉玛公司；lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜、超敏显影液购自德国Millipore公司；Kv3.4一抗购自英国Abcam公司；MMP-9一抗购自武汉赛维尔生物科技有限公司；β-actin一抗、二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNA试剂盒购自日本Takara公司；PCR引物购自上海生物工程股份有限公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司；细胞凋亡试剂盒购自上海贝博公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 OSCC细胞株SCC3来自安徽省口腔重点实验室。取对数生长期的细胞置于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d换液，待细胞达到80%汇合度时传代培养。

1.2.2SCC3细胞的免疫细胞化学和荧光成像 在共聚焦培养皿中接种2×105个细胞，培养24 h，使用PBS洗涤3次后，使用4%冷多聚甲醛固定30 min，加入1 ml 0.5% TritonX-100，置于摇床上轻摇10 min，用1% BSA封闭30 min。一抗孵育过夜，二抗避光孵育2 h，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染料(DAPI)，5 min后使用激光共聚焦显微镜观察。

1.2.3si-RNA转染 NCBI上查找KCNC4序列，设计合成3条具有KCNC4的干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，阴性对照siRNA(siRNA-NC)(引物序列见表1)，转染前18 h，将2×105个细胞接种在不含抗生素培养液的6孔板中，在转染时，将培养基替换为无血清培养基。取5 μl/孔siRNA，使用245 μl的DMEM稀释，室温静置5 min，取10 μl的lipofectamine 2000，使用240 μl的DMEM稀释，室温静置5 min，将两者混匀，静置20 min，然后加入细胞培养皿中。6 h后，将培养基更换为含10%血清的DMEM，细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。将正常培养的SCC3细胞命名为control组，将添加等量的lipofectamine 2000，消除转染试剂的干扰的SCC3细胞命名为mock组，将转染阴性对照试剂的SCC3细胞命名为Si-NC组，将转染3组siRNA-KCNC4分别命名为s1、s2、s3组。

1.2.4逆转录定量实时PCR 转染后48 h，使用TRIzol试剂从SCC3细胞中分离总RNA。根据制造商指南，使用RNA试剂盒合成cDNA。正向引物序列：5′-AGTTCCTGCTGCTTATCATCTTCC-3′，反向引物序列：5′-TCTTGAAGTCGGTGTGGTCATTAC-3′。将2 μl cDNA、10 μl SYBR和1.6 μl特异性引物混合以构建RT-qPCR反应系统，并添加ROX以校正孔间误差。反应条件为：95 ℃、2 min，95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，75 ℃、30 s，重复35个循环。采用2-ΔΔCT法比较分析基因表达。

1.2.5蛋白质印迹 转染后72 h，使用含有PMSF、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解物裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心后提取蛋白质，使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度，通过8% SDS-PAGE(MMP-9，Kv3.4)、10% SDS-PAGE(capase-3，cyclin D1，cyclin E1)分离已定量的蛋白质，并转移至PVDF膜上。使用含有5% BSA的TBS-Tween 20封闭2 h，一抗孵育过夜，将经过一抗孵育的PVDF膜与二抗孵育1 h，随后使用ECL超敏发光试剂盒检测蛋白。

1.2.6CCK-8增殖实验 转染24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，将1×104个细胞接种到96孔板中，待细胞贴壁后，分别培养12、24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8并孵育1 h，酶标仪测量450 nm波长下的OD值，每个样本做5个复孔实验，根据OD值绘制0、24、48、72 h增殖曲线。

1.2.7细胞凋亡实验 转染48 h后，使用胰蛋白酶消化，收集5×106个细胞，并用PBS洗涤3次。细胞使用Annexin V-FITC染色20 min后，再使用PI染色5 min，使用流式细胞仪进行检测和分析。Annexin V-FITC染色的细胞为早期凋亡细胞，PI染色的细胞为晚期凋亡细胞。

1.2.8基质胶侵袭测定 转染24 h后，用胰酶消化细胞，收集计数后用无血清培养基重悬，密度为4×104，接种于transwell上室，上室内预先铺设50 μl、1.25 mg/ml基质胶。用含有10% FBS的DMEM 600 μl填充transwell下室。将24孔板在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。擦拭未侵入的细胞，将小室置于多聚甲醛中固定20 min。使用双蒸水洗涤后，细胞用1%结晶紫染色15 min。放大200倍拍摄照片，使用Image J软件计数细胞。

1.2.9细胞周期实验 转染48 h后，将细胞用胰蛋白酶消化并用PBS均匀吹散，加入1 ml预冷的70%乙醇放入细胞中，4 ℃静置24 h，1 500 r/min离心5 min后收集细胞，细胞用PI在37 ℃下染色30 min，通过流式细胞术检测细胞周期，使用CytExpert软件进行最终结果分析。

表1 引物列表

2 结果

2.1 免疫细胞化学激光共聚焦镜下可见，SCC3细胞核为蓝色，Kv3.4被荧光标记为红色，可见Kv3.4广泛存在于细胞质和细胞膜上，见图1。

2.2 siRNA转染效果评估qRT-PCR和Western blot实验证实siRNA降低了Kv3.4的表达水平。qRT-PCR结果表明，转染3条siRNA后，与control组相比，s1、s2、s3组KCNC4 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(F=39.1，P<0.001)。而mock组、si-NC组与control组相比，差异无统计学意义。其中，s3具有最高的沉默效率，见图2。随后的实验选用该siRNA进行。

图1 Kv3.4在SCC3细胞中的定位 ×200 A：DAPI将细胞核染为蓝色；B：Kv3.4蛋白染为红色；C：二者合成图像

图2 siRNA降低SCC3细胞中KCNC4组 的mRNA和蛋白质表达水平

A：qRT-PCR检测KCNC4 mRNA表达水平；与control组比较：***P<0.001；B：Western blot检测证明Kv3.4表达水平

2.3 KCNC4沉默对SCC3细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示，随时间变化，各组吸光度存在差异。在48 h，与control组(1.05±0.07)和mock组(0.96±0.1)相比，si-KCNC4组(0.67±0.06)吸光度下降，差异有统计学意义(F=32.27，P<0.001)。在72 h，与control组(1.49±0.1)和mock组(1.34±0.1)相比，si-KCNC4组(0.81±0.09)吸光度下降，差异有统计学意义(F=59.46，P<0.001)，见图3。

2.4 KCNC4沉默对SCC3细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，与control组和mock组相比，si-KCNC4组凋亡细胞百分比增加，差异有统计学意义(F=467.4，P<0.001)，见图4。

2.5 KCNC4沉默对SCC3细胞侵袭的影响使用Matrigel基质胶侵袭测定来确定细胞的侵袭能力。与control组相比，si-KCNC4组侵袭细胞数明显减少，差异有统计学意义(F=33，P<0.001)。且si-KCNC4组与mock组相比，侵袭细胞数也下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。control组与mock组之间差异无统计学意义，见图5。

图3 沉默KCNC4基因后SCC3细胞的增殖能力下降情况

与control组比较：***P<0.001；与mock组比较：###P<0.001

2.6 KCNC4沉默对SCC3细胞周期的影响G0/G1期：与control组和mock组相比，si-KCNC4组的细胞比例增加，差异有统计学意义(F=58.36，P<0.001)。S期：与control组和mock组相比，si-KCNC4组细胞比例减少，差异有统计学意义(F=41.09，P<0.001)。G2/M期：与control组和mock组相比，si-KCNC4组细胞比例减少，差异有统计学意义(F=26.91，P<0.001)。由各细胞百分比变化可知，si-KCNC4组细胞周期在G0/G1期增高，在S期和G2/M期降低，见图6。

2.7 KCNC4沉默对侵袭和凋亡相关蛋白的影响与control组和mock组相比，si-KCNC4组中Caspase-3的表达水平增加。这从分子层面证明了细胞凋亡的发生。同时，实验结果表明cyclin D1、cyclin E1和MMP-9的表达水平降低，见图7，这可能揭示Kv3.4调节OSCC增殖和侵袭的机制。

图4 沉默KCNC4基因后SCC3细胞的凋亡能力增加

A：control组；B：mock组；C: si-KCNC4组；D：各组细胞凋亡率比较；与control组比较：***P<0.001；与mock组比较：###P<0.001

图5 沉默KCNC4基因后SCC3细胞侵袭性比较×200

A：control组；B：mock组；C：si-KCNC4组；与control比较：***P<0.001；与mock组比较：##P<0.01

3 讨论

电压门控钾通道是跨膜蛋白，是细胞膜中最丰富和分布最广的蛋白质。学者们认为钾通道与肿瘤的发生发展密切相关[6]。目前，推测电压门控钾通道可能通过调节细胞周期、调节基质金属酶和改变细胞体积[7]来影响肿瘤的发生和发展。有研究[8]表明，钾离子通道对细胞膜的活性在细胞有丝分裂周期的G1期起着关键作用。有学者发现在少突神经胶质瘤细胞中，钾通道的开放导致延迟外向钾电流过度表达，并参与细胞增殖的调节，影响细胞周期中的G1/S期转变[8]。体内和体外研究[1-2]发现，靶向钾通道的药物可以减弱某些肿瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，为癌症药物研究开辟了一条新途径。

Kv3.4属于Kv1-9亚家族，由KCNC4基因编码。OSCC中Kv3.4 mRNA表达增加[5]，Kv3.4特异性抑制剂BDS特异性阻断Kv3.4通道可抑制OSCC的增殖。这些研究表明，Kv3.4与OSCC密切相关。

图6 沉默KCNC4基因后SCC3细胞周期被阻滞在G1期

A：control组；B：mock组；C：si-KCNC4组；与control比较：***P<0.001；与mock组比较：###P<0.001

图7 沉默KCNC4后侵袭和凋亡相关蛋白表达水平的变化

A：cyclin D1和cyclin E1蛋白表达水平下降；B：MMP-9蛋白表达水平降低；C：caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表达水平增加

转移是癌症患者死亡的原因之一，细胞侵袭能力是癌症转移的关键。MMPs诱导细胞外基质降解，促进新生血管形成是细胞侵袭的重要过程。其中，MMP-9与肿瘤晚期侵袭和转移增加密切相关。本研究表明，沉默KCNC4可降低SCC3细胞系的侵袭能力。同时，Western blot结果显示沉默KCNC4和MMP-9表达降低。基于此，推测Kv3.4可能通过MMP-9调节SCC3细胞系的侵袭能力。值得注意的是，MMP-9与缺氧的关联已得到证实[9]。而Kv3.4是一种氧敏感通道亚基，这可能揭示Kv3.4调节MMP-9的具体机制。

细胞增殖调控机制失控是肿瘤发展的重要原因[10]。细胞周期紊乱导致细胞增殖异常。大量研究[11]表明，胞膜上钾离子通道的活性在细胞周期的G1期起着关键作用。本研究显示，敲低KCNC4可以降低cyclin D1和cyclin E1表达，阻断G1期。Cyclin D1和cyclin E1表达的峰值出现在G1的中后期，驱使细胞从G1期进入S期。细胞内和细胞外信号整合在G1-S期，此期决定了细胞增殖、分化、死亡或退出细胞周期进入G0期。一些学者认为cyclin D1和cyclin E1的过度表达将缩短细胞G1期，加快细胞分裂速度，最终导致DNA复制异常，促进细胞恶性转化[12-13]。cyclin D1和cyclin E1的表达将导致视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化，从而导致细胞不受控制的增殖[14]。结合以往的研究和本研究实验结果，推测沉默KCNC4可导致cyclin D1、cyclin E1的降解，细胞周期G0/G1被阻滞，从而抑制肿瘤细胞系增殖。近年来，已有研究[7]显示，钾离子通道的异常表达，导致细胞周期蛋白表达水平改变，引起细胞周期异常。钾通道阻滞剂可以抑制CyclinE/cdk2的活性，外向钾电流维持cdk2的活性，并调节G1/S期的转变[15]。研究[8]表明，钾通道阻滞剂仅阻断G1/S期转变，而G0期钾通道蛋白合成不依赖于RNA合成。

细胞凋亡是一个复杂的生理过程，其特征是细胞体积减小和细胞内钾离子浓度降低。Caspase-3是细胞凋亡的最关键蛋白之一，并且位于Caspase级联的最下游。随着Kv3.4表达水平的降低，Caspase-3和cleaved-Caspase-3表达增加，细胞凋亡增加。这进一步证实了敲低KCNC4对细胞凋亡的作用。

本研究首先确认了Kv3.4在OSCC细胞系SCC3中的位置，然后使用RNA干扰技术沉默SCC3中的KCNC4基因，干扰Kv3.4的表达，观察其对SCC3细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响并初步探讨了相关的分子机制。本研究验证了Kv3.4与OSCC的关联，并初步证明Kv3.4对OSCC的影响可能通过调控细胞周期，调控MMP-9和Caspase-3的表达水平来实现。这表明Kv3.4可能是OSCC的潜在靶点，为OSCC的治疗提供了新的策略。