张树东，周 建，田 壮，刘长振，姚 琦

骨质疏松是老年人的常见病和多发病，严重影响着老年人的生活质量。目前，与核因子κ-B配体的受体激活剂(receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand，RANKL)和骨硬化蛋白相关的免疫疗法在骨质疏松治疗上取得一定进展[1-2]。我们课题组欲通过将RANKL、骨硬化蛋白与Qβ病毒样颗粒(Qβvirus-like particles，Qβ-VLPs)交联制备骨质疏松相关疫苗的方式，达到防治骨质疏松的目的。Qβ-VLPs能诱导机体的免疫应答，在疫苗领域中研究很广泛，现已经与相应抗原交联制备出疟疾疫苗[3]、肿瘤疫苗[4]、寨卡病毒疫苗[5]、骨质疏松疫苗[6]，并且戒烟疫苗、高血压疫苗等已经进入临床试验阶段，表现出很好的安全性，表明Qβ-VLPs具有很大的应用于人体疫苗制备的研究潜力[7-8]。

表达并制备具有正确空间结构且纯度较高的Qβ-VLPs是将其用于后续实验的基础，Tatyana等[9]通过反转录等技术获得编码Qβ衣壳蛋白的基因C，并获得电镜下与野生型球形结构相似的Qβ-VLPs。基因C由编码Qβ衣壳蛋白的133个氨基酸(14 ku)和编码通读蛋白A1的329个氨基酸组成，A1蛋白会有部分代替衣壳蛋白单体形成180聚体颗粒[10]，在形成感染性噬菌体颗粒中发挥着重要作用[11]。本课题组设计实验进行Qβ-VLPs蛋白表达、鉴定和纯化，以获得更为安全的Qβ-VLPs。

1 材料与方法

1.1 设计 优化病毒样颗粒蛋白的表达及纯化条件。

1.2 时间及地点 实验于2017-06至2018-12在中国中医科学院医学实验中心北京市重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 菌株与质粒 大肠杆菌感受态DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)均购自天根生化科技 (北京) 有限公司，查阅文献[9]获得Qβ衣壳蛋白的序列全长，共402 bp，编码133个氨基酸，由北京普尔普乐生物科技有限公司克隆到载体质粒pET-30a上，记为pET-30a-Qβ-VLPs。

1.3.2 试剂及仪器 质粒小提试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司，卡那霉素、氯霉素购自北京索莱宝科技有限公司，0.45 μm滤器购自美国Millipore公司，蛋白Marker购自美国赛默飞公司，超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，恒温振荡器购自上海一恒公司，AKTA avant 25蛋白层析纯化系统和CL-4B分子筛填料购自美国GE公司。

1.4 实验方法

1.4.1 目的质粒的扩增及小量提取 取出合成的pET-30a-Qβ-VLPs质粒，根据说明书将质粒转化到感受态DH5α中，取出适量菌液涂布到带有卡那霉素(100 μg/ml)抗性的固体LB培养液上，倒置放置于37 ℃恒温箱过夜培养。挑取单菌落扩增，送生物公司测序。依据小提质粒试剂盒说明书的要求提取pET-30a-Qβ-VLPs质粒并于-20 ℃冰箱备用。

1.4.2 Qβ-VLPs蛋白的表达和鉴定 (1)pET-30a-Qβ-VLPs质粒的转化。预实验过程中发现使用常用的原核蛋白表达菌株BL21(DE3)并不能得到具有球形结构的Qβ-VLPs，因此本实验使用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)三种菌株进行实验。依据感受态说明书将pET-30a-Qβ-VLPs质粒转化到3种菌株中，然后涂布到添加有相应抗菌素的LB固体培养液上过夜培养，其中BL21(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)的固体LB培养液，BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)+氯霉素(25 μg/ml)的固体LB培养液。(2)菌株的诱导表达。从过夜培养的固体LB培养液上挑取单菌落，在添加有相应抗菌素的LB培养液中扩增(37 ℃，220 r/min)，待菌液浓度达到OD：0.6～0.8时，从3种不同的菌液中各取0.5 ml作为空白对照，然后向3种菌液中加入蛋白表达诱导剂IPTG使其终浓度为0.5 mM，在16 ℃、180 r/min条件下诱导培养20 h。(3)SDS-PAGE分析Qβ-VLPs蛋白。离心收集表达后的菌体，并用双蒸水清洗菌体一次。向3种菌株诱导前、后的样品中加入适量的还原型蛋白上样缓冲液，在金属浴中100 ℃加热5 min，通过使用12%的SDS-PAGE检测3种菌株是否能表达Qβ-VLPs的单体。(4)SDS-PAGE和透射电镜验证Qβ-VLPs蛋白结构。Qβ-VLPs以180聚体的形式存在，稳定的5-6聚体是其基本单位，能检测出5-6聚体的存在形式，基本可确定Qβ-VLPs球形结构的形成。取出3种诱导表达后的菌体沉淀并用超声破碎，离心收集上清液，用非还原性蛋白电泳上样缓冲液处理样品，并用SDS-PAGE检测是否形成Qβ-VLPs的5-6聚体。用5%的磷钨酸对3种Qβ-VLPs上清液进行染色后用透射电镜观察是否表达出球形结构。

1.4.3 BL21(DE3)pLysS菌株表达条件的优化 笔者通过BL21(DE3)pLysS表达出具有球形结构的Qβ-VLPs，然后设计实验优化其表达效率，IPTG在原核表达中发挥着重要作用，本次实验设置0.2 mM和0.5 mM两个IPTG浓度进行实验。按上述步骤将菌体分为2组进行扩增，待菌液OD达到0.6～0.8时暂停摇床，向菌液中滴加IPTG，使得第1组工作浓度为0.2 mM，第2组工作浓度为0.5 mM，诱导表达20 h，条件为16 ℃，180 r/min。培养结束后超声破碎菌体并离心收集蛋白上清液，用非还原性蛋白上样缓冲液处理后SDS-PAGE验证。

1.4.4 菌体破碎方式的优化 Qβ-VLPs具有一定的空间结构，不同的菌体破碎方式对蛋白产量存在一定的影响，本实验采用3种不同的菌体破碎方式进行实验，每种方式使用等量的相同表达条件的菌体进行实验。(1)超声破菌：取出冻存的菌体，用10 ml的PBS冲悬后，使用超声仪冰浴条件下破菌，超声破菌功率300 W，破碎3 s，间歇5 s，共20 min。破碎结束后4 ℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去沉淀，收集上清。(2)反复冻融破菌：取出冻存的菌体，室温融化，然后向其中加入适量液氮至菌体全部凝固，室温放置至菌体融化，然后再次加入适量液氮，重复该过程5次。操作结束后用10 ml的PBS冲悬菌体，离心取上清，弃沉淀。(3)溶菌酶裂解：用PBS溶液(含有2 mg/ml溶菌酶和0.1%Triton X 100)冲悬菌体，室温放置30 min，间歇吹打混匀，然后用20 ml注射器反复吹打破碎菌体。操作结束后离心取上清，弃沉淀。操作结束后将得到的3组蛋白上清液用0.45 μm滤膜过滤，取适量样品用非还原性蛋白上样缓冲液处理后SDS-PAGE验证实验结果。

1.4.5 Qβ-VLPs蛋白的纯化 取适量菌体超声破菌后4 ℃，12 000 r/min，离心20 min收集上清。(1)硫酸铵聚沉：向蛋白上清液中添加硫酸铵至终浓度为20%，4 ℃层析柜静置4 h后离心收集上清。再调整硫酸铵至终浓度为50%，4 ℃层析柜静置过夜，离心收集沉淀，弃去上清；(2)高速离心除沉淀：将硫酸铵聚沉得到的蛋白沉淀用适量PBS溶解后高速离心，离心条件：4 ℃，20 000 r/min，离心60 min。离心结束后，收集上清液；(3)分子筛蛋白纯化：将高速离心后得到的Qβ-VLPs上清液用10 kDa的浓缩管离心浓缩至1 ml，使用分子筛通过AKTA系统进行纯化，分段收集样品后透射电镜和SDS-PAGE验证结果。

2 结 果

2.1 不同菌株表达Qβ-VLPs结果 SDS-PAGE电泳检测结果表明，3种菌株均能表达Qβ衣壳蛋白单体，其中，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表达出具有5-6聚体的结构(图1，只提供BL21(DE3)pLysS菌株电泳结果)。透射电镜观察，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表达具有25～30 nm球形结构的Qβ-VLPs(图2)。

图1 SDS-PAGE检测BL21(DE3)pLysS菌株表达结果

用非还原性(non-reducing)蛋白上样缓冲液处理样品后，用12%的SDS-PAGE检测样品中Qβ病毒样颗粒的结果。图中箭头分别表示单体、二聚体、五聚体和六聚体

图2 电镜观察不同菌株表达Qβ-VLPs的结果

A. BL21(DE3)菌株; B. BL21(DE3)pLysS菌株; C. Rosetta(DE3)菌株

2.2 Qβ-VLPs表达条件的优化 SDS-PAGE检测，0.5 mM的IPTG时诱导表达效率较高，是0.2 mM的2.8倍(图3)。

图3 SDS-PAGE检测不同IPTG浓度对Qβ-VLPs表达影响

设置2个不同的IPTG浓度分别对Qβ病毒样颗粒蛋白进行诱导表达，观察对Qβ病毒样颗粒表达的影响。图中a表示0.2 mM的IPTG浓度，b表示0.5 mM的IPTG浓度

2.3 菌体破碎方式对蛋白产量和纯度的影响 超声破碎所得蛋白产量是溶菌酶法的1.1倍，是反复冻融法的3.5倍(图4)。

图4 SDS-PAGE检测菌体破碎方式对Qβ-VLPs蛋白产量的影响

2.4 Qβ-VLPs的纯化结果 取破碎后分离得到的Qβ-VLPs上清液经硫酸铵、高速离心进行初步纯化，然后用分子筛分离(图5A)。收集50～100 ml之间的蛋白用透射电镜和SDS-PAGE检测，可以得到纯度在90%左右、电镜下呈球形结构的Qβ-VLPs(图5B)。

图5 Qβ-VLPs的纯化及检测

3 讨 论

Qβ-VLPs具有很好的安全性和打破机体免疫耐受的功能，在疫苗研究领域具有很大的发展潜力。A1蛋白作为Qβ噬菌体中的通读蛋白，与Qβ衣壳蛋白共用起始密码子，可代替部分衣壳蛋白单体形成180聚体的病毒样颗粒[10]，但是，A1在形成感染性噬菌体颗粒中发挥着重要作用[11]。既能得到Qβ衣壳蛋白形成的病毒样颗粒，又能避免A1潜在的感染性威胁，是本实验目的之一。本实验只把Qβ噬菌体基因C中的Qβ衣壳蛋白的基因克隆到载体质粒pET30a上，不包含Qβ衣壳蛋白终止密码子后的基因序列，不能合成通读蛋白A1。笔者发现使用A1蛋白和Qβ衣壳蛋白二者存在的条件下表达病毒样颗粒的方法，与仅有Qβ衣壳蛋白时组装病毒样颗粒的条件不同，相同的条件下仅有Qβ衣壳蛋白时无法表达出病毒样颗粒。A1蛋白在Qβ-VLPs的形成和稳定中可能发挥着重要作用，本实验未做深入探讨。

本研究使用3种不同的表达菌株，最终使用BL21(DE3)pLysS菌株制备出了具有球形结构的Qβ-VLPs。该菌株带有表达T7溶菌酶基因序列的pLysS质粒，表达的T7溶菌酶可以降低目的基因的背景表达，但不干扰IPTG的诱导表达[12]，携带有pLysS质粒的菌株在原核表达中应用广泛[13，14]。降低背景蛋白表达能降低菌株的负担[15]，Qβ衣壳蛋白可以自组装形成正确空间结构，背景蛋白降低可以减弱杂蛋白对Qβ衣壳蛋白形成空间结构的影响，有利于合成正确的空间结构。

Qβ-VLPs是由180个衣壳蛋白单体组成的20面体结构，单体之间可以通过二硫键形成稳定的5-6聚体，5-6聚体的存在可以初步验证空间结构的建立[16]。本实验用SDS-PAGE验证3种菌株表达Qβ-VLPs的结果，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以形成5-6聚体，笔者进一步通过透射电镜观察3种菌株表达Qβ-VLPs的空间结构，只有BL21(DE3)pLysS形成球形结构，与5-6聚体的形成可以初步判定球形空间结构形成的结论一致。

获得Qβ-VLPs后，我们对其表达条件进行优化，IPTG在蛋白的表达过程中发挥着重要作用，可以使得生长阶段的菌株转化成表达阶段的菌株，而且诱导剂浓度可以显著影响蛋白的产量，IPTG浓度过低会使得表达产量低，过高会打破菌株代谢平衡，产生毒性[17]。本实验设计了0.2 mM和0.5 mM两个IPTG的工作浓度，结果显示，0.5 mM IPTG得到的Qβ-VLPs比0.2 mM IPTG得到的Qβ-VLPs产量高。

Qβ-VLPs具有复杂的空间结构，菌体的充分破碎，破碎过程对蛋白空间结构不造成明显影响，且破碎后的产物方便下一步的分离纯化，是选择病毒样颗粒表达菌破碎方法的重要因素。本研究设计了3种不同的菌体裂解方式，超声破碎、液氮反复冻融和溶菌酶裂解，结果发现反复冻融法得到的蛋白产量较低，因为在操作过程中会产生大量的黏性产物，离心和过滤较为困难，蛋白回收效率较低。溶菌酶法和超声破碎对Qβ-VLPs的产量影响较小，超声破碎操作简便，菌体破碎彻底，不会产生不易分离的黏性物质，并且超声破碎不会引入新的杂蛋白，不会增加后续纯化过程的难度，本次实验结果所得数据倾向于使用超声破碎法进行菌体裂解。

菌体破碎得到蛋白上清液后，本实验先用20%和50%浓度的硫酸铵进行初步纯化，然后通过高速离心进行纯化，试验过程中发现离子交换柱获得Qβ-VLPs产量较低，损失较大。因此，本次实验过程中取消离子交换柱纯化的步骤，直接通过分子筛分选即可以得到纯度较高的Qβ-VLPs。

Qβ-VLPs在纳米载体领域和疫苗领域都应用广泛，而且比其他的病毒样颗粒稳定[18]，使得有关Qβ-VLPs的研究也更为全面。Qβ-VLPs可以激发T细胞依赖和非T细胞依赖的抗体应答，Qβ-VLPs内的TLR(Toll-like receptor，Toll样受体)配体可以很大程度的促进Qβ-VLPs的免疫应答，并且B细胞内的TLR信号通路承担此效应，因此，Qβ-VLPs成为研究B细胞TLR信号的理想抗原[19]。在疫苗领域，IL-17与Qβ-VLPs交联制备的疫苗在治疗自身免疫性炎症性疾病时表现较好，对疫苗刺激机体产生的抗体进行分子水平的研究，发现自身产生的抗体与IL-17具有较高的亲和力[20]。通过α-Gal与Qβ-VLPs交联制备的疫苗可以对过敏反应和利什曼虫感染产生一定的治疗效果[21-22]。Qβ-VLPs的形成和解聚过程研究也较为充分，对Qβ衣壳蛋白解聚和组装过程进行研究，使得对Qβ-VLPs的研究更为全面[18]，也使其具有更大的潜在研究价值，本次实验制备出更为安全的Qβ-VLPs，为Qβ-VLPs后续研究奠定一定基础。

综上所述，Qβ-VLPs在疫苗研究领域发挥着越来越重要的作用，本研究通过不同表达菌株获得具有正确空间结构的Qβ-VLPs，通过改变IPTG浓度优化其表达条件，设置3种菌体破碎方式，依据本次实验结果和操作过程综合考虑选择超声破碎的方法，通过硫酸铵沉淀、高速离心和分子筛分选等蛋白纯化方案，最终制备出产量和纯度都较高的Qβ-VLPs，为Qβ-VLPs在骨质疏松疫苗领域的研究和应用奠定可靠基础。