吴萍萍， 黄丽英

金线莲为兰科开唇兰属多年生草本植物，是一种珍稀名贵药材，在民间享有“药王”、“金草”等盛誉。金线莲性凉，味甘，微苦，具有清热凉血、袪风利湿、强心利尿、固肾，平肝、止痛镇咳等功效。金线莲全草皆可入药，在东南亚及我国民间广泛用于治疗肝炎、高血压病、肿瘤、肾炎、糖尿病、小儿惊风高热等症[1-3]。近年来的研究表明，金线莲中含有多种化学成分，如黄酮类、核苷类、多糖类、生物碱、氨基酸、酯类、甾醇、三萜类、微量元素等物质[4-7]，但迄今为止，关于金线莲中核苷类成分的研究较少。

核苷类化合物作为中药材中的基础类物质之一，可以直接或间接作为药物使用，在抗病毒、抗肿瘤方面展示了不可取代的独特作用，备受研究者重视。现代药理学研究表明，核苷类成分具有保护机体组织和器官、调节免疫功能、抗癌等多种药理作用[8-9]。本研究对不同产地、不同种类、不同生长方式的金线莲中的胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6种核苷类物质进行定性分析和含量测定，研究不同金线莲中各核苷类物质含量的差异，为金线莲的质量评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药材 分别来自福建省内的金线莲，编号为A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K及L，其中按照种植方式可以分为组培、种植、野生3类。金线莲由福建医科大学天然药物化学学系张永红教授鉴别。金线莲样本材料的相关信息见表1。

表1金线莲样本材料的相关信息

Tab 1The relevant information about tested samples ofAnoectochilusRoxburghii

样本编号产地种植方式样本种类A漳州南靖组培4月红霞B漳州南靖种植5月红霞C漳州南靖组培5月红霞D漳州南靖种植12月红霞E三明永安组培4月红霞F三明永安种植5月红霞G福清种植5月红霞H福清种植6月红霞I三明永安种植6月红霞J三明永安野生有金色叶脉K三明永安野生无金色叶脉L三明永安野生有金色叶脉

A～L:为金线莲不同样本编号.

1.1.2试剂 胞嘧啶核苷(99%，Lot#L1628034)、鸟嘌呤(98%，Lot#E1605104)、腺嘌呤(99%，Lot#C1727002)、次黄嘌呤(99%，Lot#H1603061)、胸腺嘧啶(98%，Lot#H1605062)、β-胸苷(99%，Lot#H1601064)对照品均购于阿拉丁公司；甲醇、三乙胺、乙酸铵(分析纯)均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为自制双蒸水。

1.1.3仪器 液相色谱质谱联用仪(LCMS-2020型，日本Shimadzu公司)；高效液相色谱仪(LC-15C型,日本SHIMADZU公司)；Agilent TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)色谱柱(美国Agilent公司)；高速多功能粉碎机(XY-500A型,浙江省永康市松青五金厂)；医用数控超声清洗器(KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司)；高速冷冻离心机(Neofuge 18R型，力康发展有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂)。

1.2方法

1.2.1色谱分离条件 色谱柱：Agilent TC-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相：A-0.05%乙酸铵水溶液，B-甲醇，二元高压梯度洗脱程序：0～5 min，1% B；5～10 min，1%～5% B，10～30 min，25% B。流速：0.8 mL/min，检测波长：260 nm，进样量：20 μL，柱温：30 ℃。

1.2.2质谱条件 电喷雾离子源(Electron Spray Ionization, ESI)，扫描模式正离子ESI(+)，雾化气流速：1.5 L/min，干燥气流速：10 L/min，加热块温度：400 ℃，进样量：10 μL，扫描范围m/z：50～800。

1.2.3混合对照品溶液的配制 分别精密称取胞苷12.6 mg、次黄嘌呤12.1 mg、鸟嘌呤5.2 mg、胸腺嘧啶6.2 mg、腺嘌呤5.6 mg、胸苷8.4 mg置于25 mL量瓶中，加适量的0.1%氢氧化钠水溶液溶解混匀，定容至刻度，配制成含胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的浓度分别为504，484，208，248，224，336 μg/mL的混合对照品溶液，置于4 ℃的冰箱内待用。

1.2.4药材供试品的制备 取金线莲粉末(过80目筛)约1.0 g，精密称定，置于超声-微波协同萃取仪容器中，精密加入0.1%氢氧化钠水溶液20 mL，于超声-微波协同萃取仪50 ℃恒温条件下提取45 min，萃取2次，合并两次萃取液，减压旋转蒸发得浸膏，用少量水溶解定容于25 mL量瓶中， 0.45 μm微孔滤膜滤过，即为得到的供试品溶液。

2 结 果

2.1线性范围的考察 对“1.2.3”中配制的混合对照品溶液进行1/5，1/10，1/25，1/50 ，1/125，1/250，1/500 浓度稀释，得到7个不同浓度的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，按“1.2.1”项下色谱条件进行分析测定。取线性范围内最低浓度混合对照品溶液不断等倍稀释进行分析，以信噪比S/N=3作为检出限(limit of detection, LOD)，S/N=10作为定量限(limit of quantitation, LOQ)，结果见表2。

表2 线性回归方程、相关系数

LOD:检出限; LOQ:定量限.

2.2HPLC鉴定金线莲中核苷类物质 由混合对照品溶液和金线莲供试品溶液色谱图(图1，2)可知，胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤的保留时间分别是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min。根据保留时间，图2的1，2，3，4，5，6号色谱峰初步鉴定为胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.3LC-ESI(+)/MS鉴定金线莲中核苷类物质 为进一步确认这些色谱峰的归属，必须考察对应化合物在相同条件下的结构信息。在设定的HPLC-ESI(+)/MS条件下，分别对胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的对照品和供试品溶液进样，经色谱分离后对保留时间分别是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min色谱峰进行质谱分析，得到各离子峰的精确质量数，6个核苷类成分的质谱特征碎片峰归属见表3。

1：胞苷；2：次黄嘌呤；3：鸟嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.图1 混合对照品的高效液相色谱图Fig 1 Chromatography of standard sample

1：胞苷；2：次黄嘌呤；3：鸟嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.图2 供试品高效液相色谱图Fig 2 Chromatography of sample

Tab 3The belonging of secondary mass spectrum of six nucleosdies

准分子特征化合物[M+H]+碎片峰归属m/zm/z胞苷244.2111.8[M+H-rib]+94.6[M+H-rib-NH3]+68.5[M+H-rib-NH3-CN]+次黄嘌呤137.1119[M+H-H2O]+110[M+H-HCN]+鸟嘌呤152.2135.1[M+H-H2O]+109.9[M+H-NH2CN]+胸腺嘧啶127.1110[M+H-NH3]+84[M+H-NH3-CN]+腺嘌呤136.1119[M+H-NH3]+91.9[M+H-NH3-HCN]+64.8[M+H-NH3-HCN-HCN]+胸苷243.2127.1[M+H-rib]+99[M+H-rib-CO]+

m/z:质子数/电荷数的比值.

基于m/z值、结合各成分在色谱中出峰时间、对照品和文献数据进行比较和分析，保留时间为5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min处的色谱峰对应的物质分别鉴定为胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.4精密度实验 选取同一浓度的混合对照品溶液，按照“1.2.1”中色谱条件，连续进样6针，测定各成分的相应信号并计算其RSD值。胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的RSD值(n=6)分别为1.74%，1.97%，1.67%，1.06%，1.89%，1.37%，结果表明仪器精密度良好。

2.5稳定性实验 取同一供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样，测定胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并计算RSD值分别为1.42%，1.31%，1.25%，1.14%，1.27%及1.84%，说明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6重复性实验 取A金线莲粉末(过80目筛)，每份1 g，分别精密称定6份。按照“1.2.4”方法制备6份供试品溶液，按“1.2.1”中色谱条件进样，测定胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并计算RSD值，结果分别为1.61%，0.62%，0.69%，0.82%，1.32%及0.75%，表明本法重复性良好。

2.7加样回收实验 取A金线莲粉末(过80目筛)9份，每份约0.5 g，精密称定。分别按照80%，100%，120%浓度水平加入对应量的对照品溶液，按“1.2.4”中的方法制备9份供试品溶液，按“1.2.1”中色谱条件进样，计算样本的加样回收率，结果如表4所示。

2.8样品含量测定 将12种金线莲分别精密称量3份，按照“1.2.4”中制备方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”中液相色谱条件进样分析测定，测得6种核苷成分在各样本中的平均含量(表5)。

3 讨 论

本研究考察了分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸、甲醇-乙酸铵水溶液为流动相时6种核苷成分的分离效果，其中单纯以甲醇-水、乙腈-水为流动相时，色谱峰峰形较差；当有机相为乙腈时，目标色谱峰出峰较快，难以与其他杂质峰分离，因此有机相选用甲醇。选用甲醇-乙酸作为流动相时，腺嘌呤和胸苷色谱峰严重拖尾；选定甲醇-乙酸铵水溶液作为流动相时，各色谱峰得到较好的分离。

在进行供试品溶液的制备时，本研究考察了甲醇-水、乙醇-水、纯水3种提取溶剂的不同比例的溶剂对核苷及碱基类成分提取的影响。结果表明，甲醇及乙醇提取核苷类的成分含量低，色谱峰较少，无法真实有效地反映出金线莲中含有的核苷类成分的含量。由于鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤对照品在纯水中的溶解度较差，易溶于碱性溶液，所以提取溶剂也尝试了不同pH的溶剂，包括水、0.1%氨水、1%氨水、0.1%氢氧化钠水溶液、0.1%乙酸、1%乙酸等；提取效果顺序为0.1%氢氧化钠水溶液、0.1%氨水、1%氨水、0.1%乙酸、1%乙酸，结果表明0.1%氢氧化钠水溶液作为提取溶剂，各核苷类成分测得的含量较高，故最终采用0.1%氢氧化钠水溶液作为提取溶剂。

表4 回收率实验结果

RSD：相对标准偏差.

表5 6种成分在各样本中平均含量

n=3. A～L为金线莲不同样本编号.

12种金线莲样本经测定均含有胞苷、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6种成分，但各成分的含量差异较大。鸟嘌呤和腺嘌呤在各金线莲样本中含量整体较为均衡。以生长方式分类时，总核苷的含量由高到低顺序依次为:组培>种植>野生，可能因为组培金线莲的人工生长环境优越、营养更加丰富，使得金线莲代谢更加迅速，有利于核苷类成分在药材中的累积。以产地分类时，不同产地的总核苷的含量没有较大的差异，几种金线莲样本均来自福建省，各种栽培管理技术以及生长环境都相对类似，因此核苷的总量并没有显示较大的差异。

本研究采用LC-MS法分析金线莲中6种核苷类成分，建立HPLC-UV法测定金线莲中6种核苷类成分的含量，能够为金线莲品质评价和药效作用的深入研究以及质量标准的进一步完善提供参考。