郑 翔，毕文杰

显微切片扫描系统的应用与管理经验探讨

郑 翔1，毕文杰2

（1. 四川大学 华西基础医学与法医学院 基础医学专业实验室，四川 成都 610041；2. 成都医学院 人体解剖学与组织胚胎学教研室，四川 成都 610500）

根据管理和应用显微切片扫描系统的经验，围绕设备性能指标、应用场合、设备管理和标本制备技术等4个方面，阐述了当前存在的主要问题，并提出相应的改进措施。

显微切片扫描系统；切片全景成像；设备管理；显微制片

随着远程病理诊断和数字化图像分析手段的日益进步，显微切片的全景成像（whole slide imaging）和数字化建档已逐渐普及。显微切片扫描系统（microscopic slice scanning system）则在显微拍摄的功能之外，实现了整张切片全部信息的扫描采集，使实验与教学观察、图像数据分析和远程会诊的效率显著提升[1-3]。此外，切片扫描成像还大幅降低了标本的维护成本，同时避免了因实验样本或临床病例难以再次获得而造成的标本短缺[4]。目前已有不少文章探讨了数字化显微切片的应用价值[5-8]、问题与挑战[9-10]，以及扫描系统的工作模式[11-13]。我们在显微切片扫描系统的应用和管理过程中感受到：虽然大家认识到该系统的功能价值并积极使用，但大多未全面认识扫描成像模式对显微制片工作的要求，对一些配套技术的掌握尚有欠缺，所以显微切片扫描系统的应用并未真正起到提质增效和节省材料的效果。显微切片扫描系统虽然型号各异，但操作应用上有很多共通的知识和技巧。在本文中，根据近年应用显微切片扫描系统的心得，探讨该类系统的应用技术和管理经验，争取为其他单位的相关工作提供有益的参考。

1 显微切片扫描系统的技术用途和关键性能参数

之所以将显微切片用扫描的方式而不是传统的拍照方式采图，主要取其完整性。扫描获得的全景数字化切片，可在用户计算机上继续阅片和处理图像。不过，扫描采图针对的是超过1个视野的较大范围，耗时更长，某些情况下可能产生拼接痕迹，图像占用的储存空间也很大。因此，如果实验目的是要快速检片，且所需展示的结构不超过1个视野，就不必用扫描系统采图。此时传统的镜下观察、显微拍照是最快的方法。另外，如果切片展示的方式和倍数确定，也没有必要用扫描模式采图，可在扫描系统的屏幕上将切片放大倍数调整好后直接拍照。

有必要扫描成像的场合是：（1）需要呈现大于1个视野的结构；（2）未来图像的呈现倍数尚不确定；（3）有的分析和处理操作需要在不同的放大倍数下进行。有必要全片扫描的场合，则仅限于经典切片的数字化建档和某些科研阵列切片的采图。了解上述用途，有利于节省时间和磁盘空间。

尚未装配扫描系统的单位，可根据自己的实际需求，选择合理的型号。目前市售显微切片扫描系统已有数十种，仪器外观和价格迥异。从外观上，扫描系统可大致分为显微镜式和箱式两类。两类结构的核心功能都以精确电动载物台、电动物镜和电脑软件的拼接算法为基础，并无实质性的功能差别。从我们使用的经验看，箱式结构更优。因为一方面，扫描系统的操作几乎均在计算机屏幕上进行，显微镜式结构的各个准焦螺旋、调节臂和镜头不用手工操作；另一方面，显微镜式结构留下很多接口和缝隙，易受灰尘和微生物的滋扰。箱式结构在降低操作损伤和防尘方面有优势。箱式结构的缺点是不利于油镜扫描操作，大多数公司的产品仅能支持40×物镜的普通高倍扫描。Precipoint M8/O8等采用了镜头外露的半箱式结构，这类机型的扫描速度相对慢些，但在使用油镜观察和扫描的场合非常方便。

选配显微切片扫描系统时，应重点关注物镜型号、数码成像设备参数、计算机处理速度和软件易用性这4类信息。图像拼接算法以获得的显微图像为基础，且与具体的设备型号有关，因此成像和拼接的质量主要由光学器件的性能决定。

物镜仍然是最重要的部件，物镜的性能决定了扫描成像能达到的最佳质量。物镜上的铭文标识了该型号物镜的放大倍数、镜口率（或称数值孔径，numerical aperture）、焦深等参数。其中，镜口率特别重要。以40倍物镜为例，镜口率为0.95的，成像清晰度高于仅有0.65的。光学镜头成像质量好，数码CCD等电子部件的质量也应提高。

高信噪比的CCD[14]有利于获得细腻、稳定的图像。扫描和存储速度则是一项决定操作效率的指标。在特定的扫描和图像算法模式下，数字信号传输和处理的速度越快，完成扫描拼接和图像再现的时间越短，软件出错的概率越低。因此，计算机的内存越快、磁盘读写速度越快，扫描系统的性能发挥就越有保障。

相对扫描系统主机，计算机性能提升所需增加的费用很少，性能降低对操作速度的影响明显，故不可在计算机上过于节省。最后，扫描系统的软件是否简便易用，也对工作效率有影响。在功能相当的前提下，更加简易和稳定的软件环境有利于提高设备的使用率和减少操作故障；为此必须联系供应商提供样机试用，才能得出结论。上述4类参数决定了扫描系统工作的实际性能和用户体验。

2 切片采图的操作类型和应用场合

不论哪种型号，显微切片扫描系统均应具备单视野定焦拍照、单视野变焦拍照、可变倍率拍照、选区全景扫描4种操作类型。应根据标本种类和图像，灵活选择操作类型。表1列举了各种操作的应用场合。其中，单视野定焦拍照与传统的显微拍照等同，它与选区全景扫描都是使用频率最高的操作。

表1 显微切片扫描系统采图操作的基本类型和用途

选区全景扫描的不同模式在选择时应特别注意。大多数场合使用定焦快速扫描或多点聚焦扫描即可满足采图需要。多点聚焦模式下，系统在选区内选择数个位点对焦，计算出整个选区最合适的焦距，只要切片厚度均匀，采用系统计算的焦距扫描就能获得最清晰的图像。

如果薄切片的局部可能有凹凸不平的情况，或者局部厚度与周围不一致，就需要采用实时聚焦扫描。此时每移动一次视野，系统都要重新聚焦，速度明显减慢，但避免了局部成像模糊的问题。

轴融合扫描主要针对血管灌注染色、Golgi银染神经组织、铺片等厚片，理论上可将各个焦平面的图像融合并全部清晰呈现出来；此时扫描成像的速度最慢。

3 设备使用和管理中遇到的主要问题

尽管操作者可通过说明书、实验室网上规程和设备信息牌等途径方便地获知显微切片扫描系统的使用方法，但实际操作时往往存在效率低、误操作或得不到理想图像等问题。产生这些问题的主要原因是实验操作者对显微形态学数据的呈现方式缺乏经验，同时未准确理解扫描成像的原理和过程。下面几项是我们在设备管理和培训中总结的常见问题及改进方法，可显著提高操作的效率和质量。

（1）显微切片在采图前应充分阅片，确保采图部位准确、结构典型。实际工作中，绝大部分操作者在使用扫描系统前并未仔细阅片，上机后才临时寻找适合拍照和扫描的区域。扫描系统虽然采图灵活，但先须生成切片的预览图，且每次移动到新的视野要进行聚焦和扫描，耗时远长于显微镜阅片。

从以下一项简单的测试即可看出工作效率的显著差异。取胰腺高血糖素免疫组织化学染色切片，断面上仅显示了1个胰岛；请12位受过训练的实习生，先后通过传统显微镜观察照相和扫描系统采图的方法，获得1张高倍的胰岛图像；实验中显微镜和扫描系统均已完成开机自检，比较从放上切片到获得最终图像的时间以及图像的质量（主要为结构细节的清晰度、色彩、成像伪差等）。结果表明，传统显微镜的采图速度均快于扫描系统（图1），图像质量二者相当（本文未显示该图片）。

图1 显微切片扫描系统和传统显微照相在相同切片单视野拍照任务中的耗时比较（L、M为两款不同类型、不同生产厂商的切片扫描系统，传统显微镜的型号为OlympusBX41（数码相机连接电脑软件系统）; *与传统显微照相比较，P < 0.01）

扫描系统的时间主要耗费在生成切片预览图的环节。如果阅片、选区和采图均在扫描系统上进行，不仅耗时过多，还增加仪器各个电动部件的工作负荷，造成额外损耗。因此建议：扫描成像之前，应先通过显微镜阅片，快速确定切片是否可用于采图、哪些部位需要采图（在切片背面用标记笔指示）、采图后用于何种目的（涉及图像或文件夹命名，避免现场临时起名造成遗忘或混乱）。这样可大大节省上机时间，同时缩短整个采图流程的总时间，提高操作效率。

（2）目的性不强地进行全片扫描，忽视单视野拍照和可变倍率拍照的操作。扫描系统可生成全景切片图像，是有别于传统显微拍照的一项功能。实际工作中，不少操作者过度使用这种功能，反而降低效率。操作者往往希望先扫描生成全切片图像，然后回去在计算机上慢慢观察。通常，扫描系统在40×物镜的放大倍率和定焦扫描的模式下，每扫描15mm×15 mm的正方形区域，耗时为4~7 min（因机型而异）。全部采用全片扫描的方式采图，算上换片和预处理，每小时最多采集6张切片。如果观察目标仅为某个不超过单视野的结构，或在较低倍数下比较某种分布/定位的特点，单视野拍照和可变倍率拍照才是最优的操作类型。此时进行全片扫描，保留了大量无用的图像信息，速度很慢，且还得再次阅片，相当于做了一次无用功。

（3）盲目使用高倍物镜。理论上说，切片扫描系统只要安装高倍镜，就能胜任各种倍数的拍照和扫描采图。实际上，在不需要高倍镜成像的场合，盲目使用高倍镜也会大幅降低工作效率。40×物镜的视野小，不仅单视野拍照时寻找目标结构较困难，扫描速度也比20×或10×物镜慢。因此，在不需要高倍影像的场合，更换倍率合理的物镜可大幅节省操作时间。当采集厚切片图像时，还能减少出现拼接痕迹的概率。

（4）扫描模式选择不当。切片扫描成像的操作有2个基本要求：一是图像清晰，二是速度尽可能快。根据我们观察，大多数操作者倾向于选择实时聚焦扫描的模式，理由通常是担心多点聚焦和定焦扫描的图像不够清晰。其实，裱贴平整的薄切片（厚度8 μm以下），定焦扫描、多点聚焦扫描和实时聚焦扫描获得的图像，清晰度几乎没有区别。实时聚焦扫描需要耗费更长的时间，降低采图速度，并且有增加拼接痕迹的风险。以150 μm厚Golgi-Cox染色的大脑皮质切片为例，40×物镜的定焦扫描没有任何图像拼接的痕迹（图2(a)），而实时聚焦扫描则可见到（图2(b)）。相邻视野如果聚焦结果差别较大，拼接的接缝处就难以完全调整对齐。为了提高厚片扫描的焦深，更换20×物镜扫描效果更佳。如果要看清树突棘，40×物镜下进行单视野变焦拍照，效果优于扫描成像。

图2 厚度150 μm的大鼠大脑皮质Golgi-Cox染色片局部的扫描图像（白色“→”示图像拼接痕迹；标尺=200 μm；图像通过Precipoint M8系统采集）

（5）依赖系统自带的软件进行图像处理。与传统的显微拍摄系统一样，显微切片扫描系统自带的软件，能方便地进行细胞计数、长度和面积测量等分析操作，提高了实验分析的速度和准确性。同时，软件一般还附带图像处理的功能。设置该功能可能是行业竞争的结果，因为不少操作者会对图像进行技术处理，以求实现图像优化。实际上，要获得满意的显微图像，主要靠良好的标本制备技术，其次是采图设备的性能，而不是靠图像处理。图像处理（如对比度、锐化、亮度、色相、饱和度、色彩平衡等参数调整）往往损失数据细节，画蛇添足。此外，扫描生成的图像，在系统配套的计算机屏幕上呈现的颜色、亮度等，移植到别的计算机或打印设备上是否合适尚不清楚，所以不应急于进行处理。

（6）设备操作的培训压力较大，操作规程尚需改进。本单位显微切片扫描系统的登记使用人中，约30%仅使用过1次，另有约40%仅使用过2次，其他人也有不少未达到熟练的程度，操作期间寻求技术支持的频次较高。因此，设备的操作培训工作有较大压力。解决方法之一是通知有显微采图需求的人员，不定期集中开展技术培训，把方法和原理讲清楚，全程演示主要的操作。同时，把操作视频、操作规程和设备说明书上传至学校的课程资源中心共享，方便操作者预习和随时查阅。在制定操作规程的工作中，发现单一规程不能解决不同实验的需求。有必要在操作规程中增加分支选择的节点，并相应增加针对不同采图目的参考规程，避免首次操作的人员茫然无措。

4 在使用切片扫描系统的场合优化标本制备

不论成像设备如何改进，显微切片标本的制备都是关键的基础性工作。除了用好常规的显微制片技术外，还应针对新的成像设备，改进标本制备的某些方面。我们根据日常实践，认为下面几项问题需要优化，以更好地适应扫描采图的技术模式，提升试验工作的效率和质量。

（1）组织标本的取材范围应适当限制。不少实验人员在取材、制片过程中，除了目标结构，还保留了很大范围的无关组织。多余组织一方面增加化学试剂浸透的时间和难度，降低各类化学作用的均一性；另一方面还影响显微观察。传统显微拍照只显示一个视野的图像，而扫描成像则使无关组织一览无余。系统自动聚焦时，容易受到大面积多余组织的干扰，有时目标结构的成像反而不清晰。取材范围增大也造成图像占据过多的存储空间，增加数据管理维护的工作量。可见，科研工作中，要根据观察目标适当局限标本的取材范围，不要贪大求多，如此有利于提升实验效率。

（2）掌握过硬的阵列切片技术。阵列切片法是将多个断面以一定的次序裱贴在同一张载玻片上同时观察的方法。阵列切片在科研实验和临床诊断中均有广泛应用，具有实验工作量少、组间对比准确可靠和便于高通量分析等优点[15]。但阵列切片技术对操作经验要求较高，当前不少研究人员不太乐于进行这类精细而相对枯燥的操作。根据近几年的观察，实验室的学生能做冷冻切片的就不做石蜡切片，能用单片（每张玻片1个标本）解决问题的就不做阵列片，技术操作虽然简单一些，但效率低下。配备显微切片扫描系统后，如果使用阵列片，一次即可采集多组图像数据，还能在原来的基础上再大幅缩减采图和分析环节的工作量。因此，对于从事显微形态学相关工作的人员，掌握过硬的阵列切片技术是十分必要的。使用阵列切片完成同一观察任务，比使用单片快数倍到数十倍。

制作阵列切片的要领是包埋过程中保持组织硬度均一，切片操作保持稳定，以及切片裱贴方向一致。用于扫描采图的阵列切片，还应注意两点：一是尽可能排列紧密，二是各行/列平行排列。同时取材的相同种类的标本，在组织包埋时就组合在一起，即可达到上述要求。不同类型或不同取材批次的标本，可将组织周围的包埋介质（如石蜡）尽量多切去一些，以便减少阵列片的间距；裱片操作时注意行列对齐，确保各行列平行排列（图3）。达到上述要求，可节省大量用于扫描和处理空白背景图像的时间，提高采图速度。需要指出的是，有的扫描系统提供跳跃扫描模式（即自动侦测背景，跳过纯背景区域，仅扫描有结构的区域），但我们在实践中发现，如果切片裱贴不规律，这一模式容易发生局部遗漏，且在切片背景不太干净时难以达到省时的目的。

图3 阵列切片排布的优化（标本为HE染色的小鼠卵巢4 μm厚连续切片，40×物镜以实时聚焦扫描模式完成框内结构采图所需的时间）

（3）薄切片在明场显微成像中更具优势。自共聚焦显微术普及以来，不少人认为切片厚度将不再是影响成像清晰度的重要因素。以荧光为基础的各类高分辨力成像技术，记录的是标本结构自身发出的光，切片厚度只要不阻碍光的穿透，不利影响确实已有办法排除。但是，明场显微成像记录的是透射光，断面越薄，图像清晰度越高，厚切片的不利影响仍然难以克服。所以，不能认为现在对制片技术的要求降低了。要扫描获取清晰的明场显微图像，薄切片具有明显的优势。除了图像清晰度高，在薄切片上做组织化学反应，结果也更均一。此外，目前仅有石蜡切片法可确保获得完整的连续切片，因此石蜡薄切片在三维重建、回顾性研究等场合具有独特的优势。所以不论配备的切片扫描系统是否具有荧光图像处理功能，制备薄切片的技术仍十分重要。

（4）遵守切片美观性的一般原则。传统显微切片制作过程中对切片美观性的要求，在扫描成像的场合同样适用。这些关系到美观性的一般原则至少包括：结构完整、厚度薄而均匀、无褶皱和刀痕、核浆染色分明、背景及玻片清洁、裱贴位置和标签信息正确等[16]。这不仅涉及切片的外观，而且是对整套制片技术的规范。如果不遵守上述原则，难以通过扫描获得高质量的图像。比如，切片背景过深或玻片不洁净时，扫描系统会将部分背景区域误认为染色结构。结果图像白平衡不良，自动聚焦易产生较大误差，且使用跳跃扫描模式时难以节省时间。要改善该问题，必须在降低组织非特异性染色、减少染料沉淀和保持脱水、封片试剂洁净等方面下功夫。又如，有的切片裱贴位置过于靠近载玻片边缘，造成扫描系统无法采集到临近边缘的图像。载玻片在扫描成像时需要固定在载片板或载物台上，因此靠近载玻片边缘的区域，特别是与磨砂边相对的另一端，切片边缘距载玻片边界至少4 mm才保险；多数机型都用此区夹持或承载标本玻片，可能无法观察到此区内的结构。

5 结语

显微切片扫描系统为光学显微成像提供了一种新的形式，使全景数字化切片建档、显微图像分析、远程阅片和三维重建等工作变得更加方便、快捷。在使用这一新设备的同时，还应充分了解其性能特点，要清楚认识到如何正确选用各种功能模式。同时，扎实掌握新的采图模式下标本制备的关键技术。只有从应用管理和操作技术两方面做好上述工作，才能真正发挥出扫描成像的技术优势和高效率，适应实验技术的发展和进步。

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Exploration on application and management experience of microscopic slice scanning system

ZHENG Xiang1, BI Wenjie2

(1. Laboratory of Basic Medicine, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China)

Based on the experience of management and application of micro-slice scanning system, this paper expounds upon the main problems existing at present from four aspects such as equipment performance index, application occasion, equipment management and specimen preparation technology and puts forward corresponding improvement measures.

microscopic slice scanning system; slice panoramic imaging; equipment management; microscopic slicing

R32-4

B

1002-4956(2019)11-0060-05

10.16791/j.cnki.sjg.2019.11.015

2019-03-17

四川省教育厅项目（17ZB0249）；四川大学教改八期项目（SCU8333）

郑翔（1981––），男，四川成都，博士，高级实验师，主要从事显微技术和实验室管理工作。E-mail: jasondf211@163.com

毕文杰（1982—），女，山东淄博，博士，讲师，主要从事人体解剖与组织胚胎学工作。E-mail: bwj118@163.com