付晓宇，曲利娟（解放军联勤保障部队九〇〇医院病理科，福建 福州 350025）

近年来，随着手术技术的标准化、成熟化以及新型免疫抑制剂的应用等因素使肾移植的成功率有很大的提高。然而受多种因素的影响，肾功能延迟恢复及各种排斥反应仍然是导致肾移植术后并发症的主要因素，故对移植相关性肾损害的早期诊断、早期合理治疗则成为移植肾功能顺利恢复的首要因素［1］。电镜超微结构观察在移植肾早期排斥反应、移植肾复发、新发肾小球疾病的早期诊断有重要作用，两者都是导致移植物晚期丢失的重要原因，早期发现和治疗有助于延长移植物存活时间。本文将从电镜在移植肾的超微病理诊断中的应用价值进行综述。

1 电镜在肾移植诊断的优势

移植肾穿刺活检被认为是移植肾后病理诊断的金标准，随着穿刺技术的成熟，逐渐成为移植肾常规检查项目［2］。但是国内许多医疗机构受条件限制，只能开展光镜及免疫荧光或免疫组化，造成部分病例的漏误诊［3］。Haas等［4］通过回顾性研究发现，21%的肾脏穿刺标本电镜观察可以提供有效信息，并对4%的肾穿活检标本的确诊起决定性作用。Wavamunno等［5］研究发现移植性肾小球病（glomerulonephritis，GN）在出现临床症状之前，通过电镜已经能观察到组织学超微结构的改变，并且通过定期随访及病理学检查证实了电镜对GN的早期诊断具有光镜不可替代的作用，光镜首诊平均时间为2.3年，而电镜首诊平均时间为39 d，差异具有统计学意义。在一项评价类固醇治疗亚临床排斥反应的随机试验中，研究组通过超微组织学检查发现的可疑排斥反应病例，经过类固醇的预防性治疗，与对照组相比，可以明显延缓亚临床排斥反应的进展，改善肾功能状态，即对亚临床肾损害的病例早期诊断及早期治疗有利于改善肾移植的预后［6］。Buehring等［7］在肾移植后的多瘤病毒感染的研究中也有相似的结论，肾移植后多瘤病毒感染性肾病是大量应用免疫抑制剂治疗的一个并发症，通过超微结构观察，在免疫和排斥的平衡中寻找到免疫抑制剂的最小用量，降低免疫抑制剂过量引发的感染性病变，从而改善移植肾的预后。

2 电镜在移植相关性肾病诊断中的应用

2.1 肾移植后肾小球损害的超微结构观察：肾移植活检中肾小球疾病并不少见，主要包括复发性肾小球病、新发性肾小球病及移植性肾小球病，这些肾病的出现加速了移植物功能的衰退，继而失活［8］。研究表明，移植肾功能失活及慢性排斥反应是造成肾移植失败的主要原因，此外，复发性肾小球病是导致晚期移植物失功能的另一主要原因［9］。局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS） 最常见的移植相关性肾病，另外糖尿病肾病、IgA肾病、膜性肾病、膜增殖性肾小球肾炎、狼疮性肾炎等也较为常见［10］。利用光镜和免疫病理可以诊断多数复发、新发性肾小球肾病。但是早期FSGS光镜没有明显病理改变，临床表现也无特异性，常常表现为无症状或大量蛋白尿［11］，仅表现足细胞足突融合及微绒毛变性等特征性超微病理改变，如果不做电镜极易漏诊。Gallon等［12］研究表明足突融合完全可以通过血浆置换或利妥昔单抗等治疗措施恢复正常。因此利用电镜对FSGS的早期诊断可以达到早期治疗，从而延长移植物存活的目的。

糖尿病肾病是肾移植后易复发的系统性疾病，电镜表现毛细血管襻基底膜增厚，可达570 nm，足细胞足突融合脱落，系膜基质增生并形成K-W结节［13］。有文献报道IgA肾病复发率高达50%，电镜下表现系膜区及系膜旁区团块状电子致密物沉积，经免疫病理证实免疫复合物为IgA［14］。膜性肾病（membranousnephropathy，MN）的复发率为33% ～ 44%［15］，电镜下可见基底膜上皮下电子致密物沉积、钉突、链条甚至虫蚀样透亮区等特征性病理改变［16］。但文献报道复发性MN电子致密物较原发性MN明显减少［17］，可能会对光镜及免疫病理诊断造成一定困难而漏诊。膜增殖性肾小球肾炎（membranousproliferative glomerulophritis，MPGN）也好发于移植性肾小球内。Ⅰ型、Ⅲ型MPGN电镜可见基底膜内皮下、上皮下和系膜区多部位多少不等的电子致密物沉积，致密物密度较高、边界清楚；Ⅱ型MPGN（亦称致密物沉积病）的复发率较Ⅰ型、Ⅲ型高，电镜下基底膜致密层内均质连续的缎带状高电子致密物沉积是Ⅱ型MPGN的特征性病理改变。文献报道的多数致密物沉积病都是在光镜漏误诊后，由电镜进一步修正病理诊断的。另外，结缔组织疾病、淀粉样肾病、冷球蛋白血症、免疫触须样肾小球病等均可在肾移植后复发，复发后的肾脏病理改变与自体肾相似。而复发性非肾小球肾病包括草酸盐肾病、胱氨酸病、痛风性肾病和Fabry 病等，均有典型的晶体样或包涵体结构，必须通过电镜证实有否典型的包涵体而确诊［13］。

GN是抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）最典型的病变，是导致蛋白尿［18］、肌酐升高、高血压和移植物存活缩短的重要原因。目前认为GN的发病机制可能是因为血液循环中的抗移植物抗体造成内皮细胞损伤、活化引发内皮细胞的再生，产生新的基底膜物质，继而形成基底膜假双轨现象［19-20］。有学者认为GN是AMR引起的一种形态学损害，而不是一种特殊诊断［21］。

GN的诊断标准是肾小球基底膜双轨的形成，为了量化诊断标准，Banff 1997会议统一了GN的诊断标准，即形成双轨的肾小球血管襻的数量要大于10%［22］。Banff 2015会议再次修正了诊断标准，进一步量化受累肾小球血管襻双轨的数量，并对GN进行分级（表1）［23］。GN还可出现以下伴随表现：系膜基质增生、系膜溶解、局灶节段肾小球硬化、纤维蛋白沉积及微血管炎症等，这些病理表现仅有提示作用，不作为主要诊断标准［21］。GN的超微病理特征是足细胞足突消失、内皮细胞肿胀、胞浆空泡化、内皮孔丢失、肾小球内皮细胞锯齿状突起、内皮下间隙增宽、细胞碎片及纤维蛋白沉积［24］，通常不存在电子致密物沉积。Wavamunno等［25］通过对比分析发现：内皮细胞肿胀、空泡化以及内皮间隙增宽等病理学表现多在移植后1 ～ 3个月内出现。随着疾病进展，肾移植后1年内可出现肾小球基底膜双轨化，而3年后内皮孔会明显减少。这些超微特征也可以在病理诊断中给临床一个疾病进展阶段的提示，从而对临床治疗起到重要的辅助提示作用。

2.2 肾移植后肾小管间质损害的超微结构观察：1991年加拿大Banff会议，首先提出了慢性移植物肾病的概念，主要含义是间质纤维化和肾小管萎缩［26］。2001年Banff会议根据供体特异性抗体和C4d抗体作为急性AMR的特征提出了急性AMR的定义［27］。2005年Banff会议，针对肾小管萎缩及间质纤维化区域出现的作用机制不明的炎症细胞，到底是介导排斥反应的细胞抑或是萎缩肾小管的“收尸”细胞，无法达成一致意见，强调在无法确定这种组织学改变病因的情况下引入非特定来源的间质纤维化和肾小管萎缩（interstitial fibrosis and tubular atrophy，IF/TA）的概念［28］。Banff分类的更新反映了临床病理专家对肾移植术后疾病本质的认知的进步。

急性肾损伤主要由缺血和毒性损伤引起，主要累及肾小管而非肾小球。目前急性肾小管损伤（acute tubular injury，ATI）缺乏行之有效的组织损伤标记物，并且光镜下肾小管上皮细胞损伤的严重程度往往与形态学表现并不完全对应，因此电镜对肾小管损伤的诊断尤为重要［29］。缺血对肾小管的损伤造成的病理改变比较轻微，表现为刷状缘变薄或缺失，胞浆透明、颗粒状，以及远端小管管型等［30］。毒性引起的病理变化更明显、更严重，表现为近端小管细胞肿胀变浅，胞浆空泡化［31］，肾小管包涵体，肾小管周围毛细血管内皮细胞肿胀等［24］。主要机制可能与自噬［32］、凋亡［33］、坏死［34］等相关。电镜可将ATI分为早期和晚期。早期表现细胞刷状缘缺失，并出现特征性的尖膜囊。尖膜囊系肾小管上皮细胞顶端刷状缘隆起所致，胞质肿胀，有不规则嵴的梭状线粒体，肾小管上皮细胞成分与肾小管基底膜分离。晚期出现上皮细胞再生，再生的上皮细胞呈扁平状、细胞核深染，内质网扩张并占据细胞胞质的空间［30］。区分早期和晚期肾小管细胞损伤可以为临床医生提供一个关于肾小管损伤的疾病进展的概念。评估肾小管损伤的受累程度是弥漫性还是局灶性，可为急性肾损伤的病因及预后提供重要线索。

表1 Banff 2015移植肾小球病分级标准

GN患者的肾小管周围毛细血管床也可发生内皮细胞活化和基底膜损伤。发病机制同样与AMR相关，表现亦与肾小球毛细血管基底膜病变相似。Banff会议认为即使在没有肾小球的情况下，肾小管周围毛细血管基底膜多层化也可以作为慢性排斥反应组织损伤的诊断标准。Monga等［35］研究发现，由于肾小管周围毛细血管的变化往往与GN共存，依据毛细血管基底膜的多层化可以推断GN的存在或潜在可能性［36］。但许多学者认为，管周毛细血管基底膜多层化并不完全是AMR的特异性改变。有报道感染后肾小球肾炎、狼疮性肾炎、环孢菌素肾毒性和梗阻性尿路病同样会出现这个现象［37］。Banff 2015标准指出［23］：当一条管周毛细血管基底膜达到7层以上或者2条毛细血管达到5层以上，可以诊断慢性体液排斥反应。De Kort等［38］通过统计学分析发现，至少要观察10个管周毛细血管，如每个管周毛细血管基底膜平均达到2.5层，可以显著预测移植肾病变的预后。目前这一标准并未写进Banff诊断标准，也许可以期待Banff 2019诊断标准的发布。

3 移植肾电镜检查的适应证［24］

如果条件允许，建议所有移植肾病例都做电镜检查。或者出现以下任何一种情况，建议电镜检查：① 如果肾小球疾病是引起肾衰竭的病因时；② 如果存在可疑有肾小球疾病的临床表现（蛋白尿/血尿）时；③ 如果有发生AMR的风险（高风险移植、新出现的供者特异性抗体升高、原有的T细胞或抗体介导的排斥反应）；④ 如果最近1次的肾活检时间超过1年时。

出现以下情况必须做电镜检查：① 如果肾小球疾病是引起肾衰竭的病因时；② 如果存在可疑有肾小球疾病的临床或病理表现（特别是光镜下肾小球呈膜增殖性生长模式）；③ 如果患者存在发生急性AMR的高风险因素，需要寻找仅存在于超微病理的结构特征来确诊慢行活动性AMR的存在；④ 如果最近1次的肾活检时间超过1年时。

4 肾移植的基因组学时代

目前的肾脏病理诊断是通过光镜、电镜及免疫病理建立的三维诊断模式。日常工作中发现，不同病因可以引起相同的损伤病理表现，而同一病因也可以引起不同的病理表现［39］。基因组学的出现可以帮助我们追本溯源，找到疾病的本质。2013年Banff诊断及分类标准中首次提出AMR的分子诊断［40］。之后，2017年Banff会议发布分子检测指南，除了AMR，与细胞介导排斥反应密切相关的免疫损伤相关基因的检测也被纳入指南里［41］。

Venner等［42］通过多中心联合收集了肾移植后各个时间段的肾穿标本，并进行纤维化的相关分子检测，发现肾移植术后第一周就存在肉眼无法观测到的纤维化，光镜在几个月后才会观察到这种纤维化。而早期肾移植标本中的纤维化并不会引起AMR或GN甚至导致移植物丢失，可能只是肾移植过程中对损伤因素的反应。研究还发现出现纤维化之前就存在转录位点AKI（acute kidney injury，AKI）和 FICOL（Fibrillar collagen）的表达。AKI是急性肾损伤的信号，它包括损伤修复相关转录物（IRRATS），代表了肾脏对损伤的反应［43］。在肾移植术后早期，AKI与功能抑制、恢复和间质炎症有关［44］。肾移植后早期，几乎所有AKI高表达的移植肾均长期存活［45］。如移植肾间质出现纤维化，可检测到IGT（immunoglobulin transcripts）和MCATs（mast cell transcripts ）等转录位点。此外，还发现TxBx对移植早期萎缩纤维化有重要意义［46］。

除了介导排斥反应的炎症细胞，其他炎症细胞并不是导致移植肾损伤的主流因子。相反，这些细胞有利于损伤修复和监测近期移植肾肾单位损伤的活跃度［47］。主要的上游调控因子有：IL1B、OSM、INF、IFNG以及TGFB1［48］。当损伤发生时，巨噬细胞的IL1B、TNF和OSM会促进炎症对损伤的修复［46］，引发损伤修复及萎缩纤维化的多种细胞表达OSM［49］，损伤的上皮细胞则会表达TGFB1 ITGB6［50］,推测炎症细胞是通过MIR21信号通路参与修复的过程［51］。通过一系列分子表型检测，发现并证实了移植肾损伤反应的时间序列，即急性肾损伤转录物的立即表达、数周后的纤维胶原转录物及数月后出现免疫球蛋白和肥大细胞转录物，据此可以推测移植肾损伤的进程及程度。Venner等［42］发现晚期肾活检组织中的纤维化与损伤及炎症反应相关，肾单位损伤引起纤维化并最终进展为肾衰竭。

其他还有VCAN高表达于肾小管上皮细胞，NNMT高表达与内皮细胞和上皮细胞，还发现与肺纤维化相关的CXCL6趋化因子也会在移植肾中高表达，其高表达与移植物失活相关［52］。与肾单位损伤相关的还有WNT/β-catenin信号通路，其主要的上游调控转录因子是RXRA、SREB1、HNF1A和 HNF4A 等［42］。

但是Banff 2017诊断标准没有具体推荐分子表型及检测平台，可能原因是AMR/TCMR没有特异性的损伤，肾移植后的并发症仍难以简单归结为单一的、特异性的基因转录表达。分子检测应用到病理诊断可能还需要时间。

5 小 结

电镜超微结构病理改变和特殊结构的观察，可以弥补光镜、免疫病理的不足，为移植相关性肾病的病因诊断、组织学诊断提供更为准确的依据。尤其慢性AMR是晚期移植物失活的重要原因，电镜检查作为早期诊断的一种潜在工具，可以有效延长移植物存活。综上所述，电镜可以为移植肾病理诊断提供更为有意义的参考佐证，提高疾病的诊断准确性，对于临床提高疾病诊断的精确性和加强对疾病发病机制的认识具有重要意义。