李秀艳，郭丽，卜琦，王玉梅

(1 天津市滨海新区大港医院，天津300270；2 天津市北辰区中医医院；3 天津市第五中心医院)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，全球范围内每年新发病例超过50万例、死亡病例超过26万例[1]。近年来，随着宫颈细胞学等早期筛查技术的广泛开展，越来越多的宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌病死率已有明显下降趋势[2]。但晚期宫颈癌患者预后仍然较差，5年生存率不足15%[3]。目前，关于宫颈癌发生、发展的分子机制仍不十分清楚，尚需进一步深入研究。长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸，具有多种调控功能的一类RNA分子，可通过参与基因表达调控，影响细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤形成和恶性进展等生理或病理生理过程。生长阻滞特异性抑制物5(GAS5)属于lncRNA家族成员之一，定位于人染色体1q25.1，在胚胎和机体成熟组织中广泛表达，其编码转录本的部分二级RNA结构能够模拟糖皮质激素反应元件，可与糖皮质激素受体的DNA结合结构域结合，阻止糖皮质激素受体被激活，从而阻止相应靶基因转录。近年研究发现，lncRNA GAS5可下调多种组织中癌基因表达，从而影响乳腺癌、宫颈癌等细胞增殖、侵袭和迁移，是一种潜在的肿瘤抑制因子[4，5]。微小RNA(miRNA)是一种长度为20～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，以往被认为是转录过程中的“分子垃圾”。近年研究发现，成熟的miRNA加入RNA诱导的沉默复合物中，可通过与靶mRNA的不完全碱基配对识别，导致靶mRNA的翻译抑制或去稳定化，影响基因表达，从而调控肿瘤的发生、发展。miR-205是miRNA家族的重要成员。既往研究发现，miR-205在非小细胞肺癌、子宫内膜癌等组织中异常表达，可通过激活雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进基质金属蛋白酶9表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[6]。有研究表明，lncRNA GAS5可作为分子海绵结合miRNA，如miR-196等，从而影响其对靶基因的调控，继而导致肿瘤恶性进展[7]。但目前lncRNA GAS5、miR-205在宫颈癌发生、发展中作用的报道较少。为此，本研究观察了宫颈癌组织lncRNA GAS5、miR-205表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年6月～2017年12月天津市滨海新区大港医院和天津市北辰区中医医院收治的初诊宫颈癌患者93例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合宫颈癌诊断；②FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期[8]；③均行宫颈癌根治术，术前未接受任何抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他脏器恶性肿瘤或心、肝、肾等重要脏器严重功能不全者；②术前接受抗肿瘤治疗者；③合并急慢性感染性疾病或免疫系统疾病者；④临床病理资料不完整者。患者年龄31～69岁，其中<45岁26例、≥45岁67例；肿瘤直径：<4 cm 53例，≥4 cm 40例；组织分化程度：高中分化21例，低未分化72例；FIGO分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期68例；肿瘤浸润深度：<1/2肌层52例，≥1/2肌层41例；有淋巴结转移38例，无淋巴结转移55例。本研究经天津市滨海新区大港医院、天津市北辰区中医医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 lncRNA GAS5、miR-205表达检测 取手术切除的宫颈癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘1.5～2.0 cm并经组织病理检查证实为正常宫颈组织)，采用TRIzol法提取组织总RNA，经超微量紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.1，可用于后续实验。按TaqMan miRNA反转录试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA，反应条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。lncRNA GAS5、miR-205引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：lncRNA GAS5上游引物5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′、下游引物5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′，内参CAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′、下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；miR-205上游引物5′-CCCAAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3′、下游引物5′-CCGCTCGAGGAAGCACGCACACTCCAGATG-3′，内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。PCR反应体系共20 μL：模板cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Premix 8 μL，不含RNase去离子水10 μL；反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s共40个循环(lncRNA GAS5)；95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40个循环(miR-205)。所有反应在ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上完成。以CAPDH或U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与癌旁正常组织lncRNA GAS5、miR-205表达比较 宫颈癌组织与癌旁正常组织lncRNA GAS5相对表达量分别为0.52±0.17、1.04±0.14，miR-205相对表达量分别为1.12±0.34、0.59±0.12。宫颈癌组织lncRNA GAS5相对表达量明显低于癌旁正常组织，miR-205相对表达量明显高于癌旁正常组织(t分别为22.771、14.176，P均<0.05)。

2.2 宫颈癌组织lncRNA GAS5表达与miR-205表达的关系 Pearson相关分析显示，宫颈癌组织lncRNA GAS5相对表达量与miR-205相对表达量呈负相关关系(r=-0.473，P<0.05)。

2.3 宫颈癌组织lncRNA GAS5、miR-205表达与患者临床病理特征的关系 宫颈癌组织lncRNA GAS5相对表达量与肿瘤直径、FIGO分期及淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄、组织分化程度、肿瘤浸润深度无关(P均>0.05)；miR-205相对表达量与FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关(P均<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织lncRNA GAS5、miR-205表达与患者临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率居女性生殖系统恶性肿瘤首位，并呈年轻化趋势。近年来，随着宫颈癌筛查、预防及对癌前病变早期诊断技术的不断发展，患者病死率已有明显下降趋势。但对晚期宫颈癌患者，预后仍然较差。因此，进一步阐明宫颈癌发生、发展的分子机制，寻找肿瘤早期诊断的分子标志物和潜在的治疗靶点具有重要意义。

在人类基因组中，非编码序列占97%左右，可表达产生大量非编码RNA。这些非编码RNA在细胞生命活动和个体发育等方面发挥重要的调节作用。近年研究发现，在非小细胞肺癌、结直肠癌等组织中存在非编码RNA异常表达现象，可通过调节癌基因或抑癌基因表达，影响肿瘤的发生、发展，有可能成为某些肿瘤诊断的生物学标志和潜在的治疗靶标[9]。lncRNA是长度大于200个核苷酸，具有多种调控功能的一类RNA分子，能够通过调节染色质重塑、转录、转录后修饰等生物学过程，参与慢性炎症、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等疾病的发生、发展过程[10]。有研究表明，lncRNA能够在转录和转录后水平调控基因表达，通过调控多种靶基因来发挥癌基因或抑癌基因作用，从而影响肿瘤的发生、发展[11]。GAS5属于lncRNA家族成员之一，定位于人染色体1q25.1。近年研究发现，lncRNA GAS5可通过直接作用或与miRNA相互作用影响靶基因表达，在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用[12]。但lncRNA GAS5在宫颈癌中作用的报道较少。本研究结果发现，宫颈癌组织lncRNA GAS5相对表达量明显低于癌旁正常组织，表明lncRNA GAS5在宫颈癌中可能亦具有抑癌作用。目前，lncRNA GAS5在宫颈癌中具体的作用机制尚不清楚，可能与lncRNA GAS5基因启动子甲基化导致基因表达沉默有关；也可能与miRNA可结合于lncRNA GAS5信使RNA，使lncRNA GAS5稳定性下降，从而抑制lncRNA GAS5表达有关[13]。Li等[14]研究发现，lncRNA GAS5过表达能通过调节细胞周期蛋白D1、p21和凋亡蛋白酶激活因子1表达，抑制卵巢癌细胞增殖。本研究结果发现，宫颈癌组织lncRNA GAS5相对表达量与肿瘤直径、FIGO分期及淋巴结转移有关，与患者年龄、组织分化程度、肿瘤浸润深度无关，提示lncRNA GAS5低表达与宫颈癌恶性进展有关，与Li等[14]报道基本一致。

miRNA是一种长度为20～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，能够通过调节靶基因蛋白表达，在机体生长、发育等方面发挥重要调节作用。近年研究发现，miRNA还可作为多种肿瘤早期诊断和预后判断的生物标志物[15]。miR-205是miRNA家族的重要成员。既往研究发现，miR-205在非小细胞肺癌、子宫内膜癌等组织中异常表达，可通过激活雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进基质金属蛋白酶9表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，有望成为肿瘤早期诊断和预后判断的生物标志物[6，16]。但miR-205在宫颈癌中作用的报道较少。本研究结果发现，宫颈癌组织miR-205相对表达量明显高于癌旁正常组织，提示miR-205有可能参与宫颈癌的发生、发展，但其具体作用机制尚不清楚。本研究结果还发现，宫颈癌组织miR-205相对表达量与FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关，与患者年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关，提示miR-205高表达与宫颈癌恶性进展有关，与Ma等[17]报道基本一致，其作用机制可能与miR-205具有促进上皮间质转化相关标志物基因的表达有关[18]。

有研究报道，lncRNA SNHG5可作为竞争性内源RNA结合并抑制miR-205表达，进而抑制肿瘤恶性进展，而敲除lncRNA SNHG5表达后miR-205表达升高，则可促进肿瘤恶性进展[19]。本研究相关性分析显示，宫颈癌组织lncRNA GAS5表达与miR-205表达呈负相关关系，表明lncRNA GAS5亦能通过结合并抑制miR-205表达，进而抑制宫颈癌恶性进展[20]，但二者具体的相互作用机制仍需进一步研究。

综上所述，宫颈癌组织lncRNA GAS5表达下调、miR-205表达上调，二者共同参与宫颈癌形成和恶性进展。lncRNA GAS5、miR-205有可能成为宫颈癌筛查的生物标志物和治疗靶点。