周兵，林爱珍

(湖北省中医院，武汉430061)

结肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐年上升并呈年轻化趋势[1]。虽然结肠癌的治疗手段有多种，如手术治疗、放射治疗、化学治疗等[2]，但这些治疗手段对晚期结肠癌的治疗效果有限[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控及转录后调控等层面上调控基因表达[4]。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，可与靶mRNA结合，通过翻译水平抑制或断裂靶mRNA而调控基因表达。研究证实，lncRNA、miRNA均可参与恶性肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等生物学过程[5,6]。CYTOR是lncRNA家族成员之一，在非小细胞肺癌、胆囊癌、肝癌等恶性肿瘤组织中高表达，可作为一种促癌基因发挥作用，且其高表达与患者预后不良有关[7,8]。miR-206是miRNA家族成员之一，在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤组织中低表达，可作为抑癌基因发挥作用[9,10]。有研究证实，CYTOR与miR-206存在潜在的结合位点，miR-206有可能通过“sponge”机制受上游靶基因CYTOR调控。但目前鲜见CYTOR、miR-206在结肠癌发生、发展中作用的报道。为此，本研究观察了结肠癌组织CYTOR、miR-206表达变化，并在细胞实验中进一步探讨二者表达变化对结肠癌细胞生物学行为的影响及二者的调控关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2017年10月～2018年1月湖北省中医院收治的结肠癌患者30例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合结肠癌诊断；②符合结直肠癌根治术或姑息手术的手术指征；③初诊，术前未行任何抗肿瘤治疗。排除标准：①既往有其他部位恶性肿瘤病史者；②合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者；③全身情况不良，不能耐受手术者；④存在凝血功能障碍者。其中，男17例、女13例，年龄43～68(55.29±10.56)岁；肿瘤部位：升结肠5例，横结肠4例，降结肠5例，乙状结肠6例，直肠10例；Dukes分期：A期9例，B期11例，C期9例，D期1例。本研究经湖北省中医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

人结肠癌细胞株LoVo、人胚肾上皮细胞系HEK-293T(以下分别称LoVo细胞、HEK-293T细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。CYTOR shRNA与阴性对照shRNA、miR-206 mimics与阴性对照miRNA及所有引物序列，由上海吉凯基因科技有限公司提供；荧光素酶报告基因载体(pmirGLO质粒)，美国Invitrogen公司。实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；Multiskan MK3型酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，美国Corning公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR®Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa株式会社；TaqMan microRNA定量PCR试剂盒，美国ABI公司；CCK-8试剂盒，湖北百奥斯生物科技有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，北京艾然生物科技有限公司。

1.2 结肠癌组织与癌旁正常组织CYTOR、miR-206表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的结肠癌组织及其配对的癌旁正常组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，经NanoDrop 2000超微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTM(CYTOR)或TaqMan microRNA定量PCR试剂盒(miR-206)说明进行PCR扩增。引物序列：CYTOR上游引物5′-AGAATGAAGGCTGAGGTGTG-3′、下游引物5′-CAGCGACCATCCAGTCATTTA-3′，内参GAPDH上游引物5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′、下游引物5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；miR-206上游引物5′-GCGTCTGGAATGTAAGGAAGTG-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，内参U6上游引物5′-TTGGTCTGATCTGGCACATATAC-3′、下游引物5′-AAAAATATGGAGCGCTTCACG-3′。根据相应试剂盒说明配制反应体系并设置反应条件，所有步骤在实时荧光定量PCR仪中完成。以GAPDH或U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞转染 将LoVo细胞接种于含10% FBS、1%青链霉素双抗的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每隔3 d换液1次。待细胞充分融合时，按1∶3传代。取传2代、对数生长期、生长状态良好的LoVo细胞，接种于6孔板，每孔4×105个，随机分为CYTOR组与对照1组、miR-206组与对照2组，每组设3个复孔。然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞生长融合70%左右时，CYTOR组与对照1组分别转染CYTOR shRNA、阴性对照shRNA，miR-206组与对照2组分别转染miR-206 mimics、阴性对照miRNA。CYTOR组与对照1组转染12 h，将无血清培养基更换为完全培养基，继续转染48 h，收集细胞；miR-206组与对照2组转染24 h，将无血清培养基更换为完全培养基，继续转染24 h，收集细胞。采用RT-qPCR法检测各组CYTOR或miR-206表达。检测步骤同1.2。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。收集各组转染后细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成密度为3×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液100 μL接种于96孔板，然后将96孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。分别于培养24、48、72、96 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1 h。采用Multiskan MK3型酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。以OD450值代表细胞增殖能力。每组设6个复孔。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 细胞侵袭和迁移能力检测 采用Transwell小室实验。收集各组转染后细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成密度为1×105个/mL的细胞悬液。细胞侵袭实验时，将Transwell小室底部膜的上表面用基质胶覆膜并孵育过夜。次日，将含无血清培养基的Transwell小室上室加入细胞悬液200 μL，下室加入含10% FBS的DMEM培养基600 μL。然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养24 h，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去上室面基质胶和未穿膜细胞。用4%多聚甲醛固定穿过Transwell小室的细胞，0.1%结晶紫染色。倒置相差显微镜下计数穿膜细胞数。随机选取5个100倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。细胞迁移实验时，Transwell小室上表面未用基质胶覆膜，其余步骤同侵袭实验。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 CYTOR靶向调控miR-206检测 通过StarBase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)确定CYTOR和miR-206的结合位点，采用双荧光素酶报告基因实验验证CYTOR与miR-206的靶向关系。将野生型和突变型CYTOR序列转入pmirGLO质粒的荧光素酶基因下游，分别得到野生型、突变型结合序列载体(pMIR-CYTOR-wt、pMIR-CYTOR-mut)。将HEK-293T细胞接种于12孔板中，随机分为pMIR-CYTOR-wt+miR-206 mimics组、pMIR-CYTOR-wt+阴性对照miRNA组、pMIR-CYTOR-mut+miR-206 mimics组、pMIR-CYTOR-mut+阴性对照miRNA组。当细胞生长融合80%左右时，按Lipofectamine®3000说明，pMIR-CYTOR-wt+miR-206 mimics组转染pMIR-CYTOR-wt、miR-206 mimics，pMIR-CYTOR-wt+阴性对照miRNA组转染pMIR-CYTOR-wt、阴性对照miRNA，pMIR-CYTOR-mut+miR-206 mimics组转染pMIR-CYTOR-mut、miR-206 mimics，pMIR-CYTOR-mut+阴性对照miRNA组转染pMIR-CYTOR-mut、阴性对照miRNA。转染48 h，去除培养基，PBS清洗后加入裂解液裂解细胞，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁正常组织CYTOR、miR-206表达比较 结肠癌组织与癌旁正常组织CYTOR相对表达量分别为1.658±0.142、0.958±0.094，miR-206相对表达量分别为0.627±0.049、1.025±0.096，两者比较P均<0.01。

2.2 结肠癌组织CYTOR表达与miR-206表达的关系 Pearson相关分析显示，结肠癌组织CYTOR相对表达量与miR-206相对表达量呈负相关关系(r=-0.599，P<0.01)。

2.3 LoVo细胞CYTOR、miR-206转染效率验证 CYTOR组与对照1组CYTOR相对表达量分别为0.281±0.012、0.982±0.103，两组比较P<0.05；miR-206组与对照2组miR-206相对表达量分别为3.582±0.315、1.023±0.981，两组比较P<0.05。

2.4 下调CYTOR表达或上调miR-206表达对LoVo细胞增殖能力的影响 见表1、2。

表1 下调CYTOR表达对LoVo细胞增殖能力的影响

注：与对照1组比较，*P<0.05。

表2 上调miR-206表达对LoVo细胞增殖能力的影响

注：与对照2组比较，*P<0.05。

2.5 下调CYTOR表达或上调miR-206表达对LoVo细胞侵袭和迁移能力的影响 细胞侵袭实验时，CYTOR组与对照1组穿膜细胞数分别为(72.2±6.1)、(105.2±9.2)个，两组比较P<0.05；miR-206组与对照2组穿膜细胞数分别为(65.2±6.1)、(98.2±7.2)个，两组比较P<0.05。细胞迁移实验时，CYTOR组与对照1组穿膜细胞数分别为(52.1±5.3)、(86.2±7.1)个，两组比较P<0.05；miR-206组与对照2组穿膜细胞数分别为(43.1±3.2)、(78.2±6.1)个，两组比较P<0.05。

2.6 CYTOR靶向调控miR-206验证 在StarBase数据库中搜索CYTOR潜在的目标基因，结果发现CYTOR包含miR-206的保守目标位点，见图1。双荧光素酶报告基因实验显示，pMIR-CYTOR-wt+miR-206 mimics组荧光素酶活性为0.342±0.031，pMIR-CYTOR-wt+阴性对照miRNA组为0.89±0.08，pMIR-CYTOR-mut+miR-206 mimics组为0.868±0.072，pMIR-CYTOR-mut+阴性对照miRNA组为0.912±0.092。pMIR-CYTOR-wt+miR-206 mimics组荧光素酶活性明显低于其他三组(P均<0.05)，而其他三组两两比较P均>0.05。

图1 miR-206与CYTOR的结合位点示意图

3 讨论

结肠癌是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，其发病机制尚不清楚。近年随着经济发展，人民生活水平提高和生活方式转变，结肠癌的发病率明显上升并呈年轻化趋势。目前，外科手术仍是结肠癌早期最重要和最有效的治疗手段，术后5年生存率90%以上。但由于结肠癌早期症状不明显，大部分患者确诊时已属中晚期，约20%患者在确诊时已出现了远处转移，错过了最佳手术时机，只能采取放射治疗、化学治疗等，其治疗效果有限。因此，探索结肠癌发病的分子机制，寻找更准确的分子标志物，对结肠癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

lncRNA是一类定位于细胞核或细胞质，转录本长度超过200 nt且以RNA形式调控基因表达的非编码RNA。有研究发现，lncRNA通过基因沉默、组蛋白修饰、转录激活和干扰等方式调控基因表达，能够参与恶性肿瘤相关的信号通路，影响细胞增殖、肿瘤免疫逃避、血管生成等一系列与恶性肿瘤发生、发展相关的生物学过程[11，12]。越来越多研究发现，结肠癌组织中存在多种差异表达的lncRNA，这些差异表达的lncRNA有可能作为结肠癌早期诊断的分子生物标志物和潜在的治疗靶点[13]。如lncRNA BANCR在结肠癌组织中高表达，且其高表达与淋巴结转移呈正相关关系，可提示患者预后不良[14]；lncRNA CPS1-IT1在结肠癌组织中低表达，其低表达与肿瘤细胞增殖和迁移能力增强有关，亦可提示患者预后不良[15]。CYTOR是近年新发现的一种lncRNA。有研究证实，CYTOR是恶性肿瘤发生、发展过程中的关键调控分子。Zhu等[16]研究发现，下调CYTOR表达可通过负性调控miR-4775表达而促进胶质瘤细胞增殖和侵袭能力；Wang等[17]研究发现，下调CYTOR表达可通过调节miR-193b-3p/ETS1轴而抑制胃癌进展。但鲜见CYTOR在结肠癌发生、发展中作用的报道。本研究结果发现，结肠癌组织CYTOR相对表达量明显高于癌旁正常组织；下调CYTOR表达，能够明显抑制结肠癌LoVo细胞增殖、侵袭和迁移。结果提示CYTOR在结肠癌中具有促癌基因作用。

miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，可与靶mRNA结合，通过翻译水平抑制或断裂靶mRNA而调控基因表达。通常认为，lncRNA通过碱基互补配对作用干扰miRNA的生物学功能，而miRNA在恶性肿瘤发生、发展过程中亦具有重要作用，其表达上调或下调均可影响肿瘤细胞的生物学行为。miRNA表达变化与结肠癌的发生、发展有关。如在结肠癌组织中miR-495表达下调，其表达下调能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[18]。miR-206是miRNA家族成员之一，在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤组织中低表达，可作为抑癌基因发挥作用[9,10]。但鲜见miR-206在结肠癌发生、发展中作用的报道。本研究结果发现，结肠癌组织miR-206相对表达量明显低于癌旁正常组织；上调miR-206表达，能够明显抑制结肠癌LoVo细胞增殖、侵袭和迁移。

本研究发现，结肠癌组织CYTOR相对表达量与miR-206相对表达量呈负相关关系。但CYTOR是否通过调控miR-206发挥作用尚不清楚。本研究在StarBase数据库中搜索CYTOR潜在的目标基因，结果发现CYTOR包含miR-206的保守目标位点；双荧光素酶报告基因实验结果显示，pMIR-CYTOR-wt+miR-206 mimics组荧光素酶活性明显低于pMIR-CYTOR-wt+阴性对照miRNA组、pMIR-CYTOR-mut+miR-206 mimics组、pMIR-CYTOR-mut+阴性对照miRNA组，而pMIR-CYTOR-wt+阴性对照miRNA组、pMIR-CYTOR-mut+miR-206 mimics组、pMIR-CYTOR-mut+阴性对照miRNA组两两比较差异均无统计学意义。证实miR-206是CYTOR的下游靶分子，即CYTOR通过靶向调控miR-206表达促进结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。

综上所述，CYTOR通过靶向抑制miR-206表达促进结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。