蔡泓 卢莎 陈岳明 卓广超 张治芬

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是目前全世界最常见的慢性肝脏疾病，疾病谱包括单纯非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化甚至肝细胞癌。尽管NAFLD起病隐匿，但如能积极开展早筛查、早干预，则能够获得良好的临床防治效果。肝脏脂质合成代谢和转运调控在NAFLD发病中起主要作用，其中脂肪酸合成酶（FAS）和固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）蛋白表达上调，被认为对肝脂肪变性具有重要意义。流行病学调查研究显示，绝经后女性NALFD发生率显著升高[1]。绝经是女性发生NAFLD的独立危险因素[2]，但其视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4,RBP4）是一种新型脂肪细胞因子，被认为可作为胰岛素抵抗的标志物[3-4]。多数临床研究发现，无论成人或儿童，血清RBP4蛋白表达水平在NAFLD患者均高于健康人群[5]，但其与NAFLD之间的相关性尚未获得一致确认[6]。本团队前期研究发现，外周血RBP4蛋白表达水平与绝经后女性NAFLD相关，对这一人群的NAFLD具有诊断标志物的潜在价值[7]。本研究采用小鼠高脂饮食诱导及去势模拟女性绝经后NAFLD状态，通过分子生物学和病理学观察外周血清及肝组织中RBP4、FAS和SREBP-1c蛋白表达水平的改变，探讨RBP4蛋白在绝经后NAFLD发病中的意义，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄雌性SFP级C57BL/6小鼠30只，体重（16.1依0.8）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，于浙江中医药大学动物实验中心分笼饲养。

1.1.2 高脂饲料 由浙江中医药大学动物实验中心提供，脂质含量42%，为模拟“西方饮食”配方。对照正常饲料脂质含量12.6%。

1.1.3 主要试剂 小鼠RBP4、FAS抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；SREBP-1c抗体购自美国GENE原TEX公司；3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、茁-肌动蛋白（茁-ACTIN）及HRP标记山羊抗小鼠抗体均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；RBP4蛋白酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自美国ABcam公司。

1.1.4 主要仪器 倒置相差显微镜（日本Nikon公司，Eclipse Ci型）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司，micro21R型）；蛋白凝胶电泳系统（美国Bio-rad公司，chemidoc XRS+型）等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 将30只小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为高脂+去势组、高脂组和对照组3组，每组10只。高脂+去势组：去势后，给予42%高脂饲料；去势组：去势后给予正常对照饲料；对照组：实施假手术后，给予正常对照饲料。去势手术方法如下：小鼠禁食过夜后，根据体重（0.004ml/kg）予腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉，取下腹阴道口正中上方1～2cm处切口，分离卵巢周围脂肪组织后结扎卵巢周围血管及输卵管，切除卵巢。假手术实施如下：以同样的方法实施麻醉并打开小鼠腹腔找到卵巢，仅切除卵巢周围少量脂肪组织，保留双侧卵巢，切除脂肪组织体积约等同于卵巢组织。所有小鼠手术后背部注射青霉素钠20 000U/支预防感染。术后连续观察阴道脱落细胞涂片1周，细胞涂片提示去势小鼠阴道上皮持续无角化状态，动情周期消失，证实去势造模成功。造模后每周1次禁食10h后称重，每4周1次禁食后尾静脉采血，测得小鼠血浆ALT水平明显升高、体重显著增加，表示NAFLD造模成功。所有小鼠造模20周后断颈处死，心脏取血。

1.2.2 体重及肝脏指数检测 3组小鼠建模后每周禁食10h后称重；处死后即刻摘取肝脏称重。肝脏指数=肝脏湿重（g）/体重（g）伊100%。

1.2.3 病理学检查 取小鼠同部位肝组织2份，1份经10%中性甲醛液固定、脱水、石蜡包埋、切片，脱蜡后进行HE染色，光镜下观察肝组织形态学改变；1份于-20益冻存后行油红O染色，光镜下观察肝细胞质内脂质沉积情况。参照美国国立卫生研究院NAFLD临床研究网病理工作组指南进行NAFLD活动性积分（NAFLD activity score，NAS）评定。NAS积分（0～8分）包含下列内容：（1）肝细胞脂肪变性：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）。（2）小叶内炎症（20倍镜计数坏死灶）：0分，无；1分（＜2个）；2分（2～4个）；3分（＞4个）。（3）肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分可诊断为NASH，介于两者之间为NASH可能。不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变性＞33%者为NAFL。肝纤维化评分参照Ishak标准：S0为无纤维化；S1为部分门管区有纤维增生，有或无短的纤维隔膜；S2为大多数门管区有纤维增生，有或无短的纤维隔膜；S3为大多数门管区有纤维增生，偶见门管区以纤维桥连；S4为门管区纤维增生，同时伴有明显的纤维桥连；S5为明显的桥连，偶见结节；S6为可能或明确的肝硬化。

1.2.4 血清RBP4蛋白表达水平检测 采用ELISA法。处死小鼠后收集心脏血液标本，即刻3 500r/min低温离心10min，吸取上层血清-20益保存。集齐所有样本统一交专人严格按照ELISA试剂盒说明书进行血清RBP4蛋白水平测定。

1.2.5 肝组织RBP4蛋白表达水平检测 采用免疫组织化学染色法。取上述未染色石蜡切片以ABC法行免疫组化染色。每张切片至少3个200倍视野拍照，保持背景光一致，采用Image-Pro Plus 6.0软件准确选取棕黄色作为阳性的统一标准值，分析照片中阳性面积的累积光密度值（IOD）。

1.2.6 肝脏RBP4及FAS、SREBP-1c蛋白表达水平的检测 采用Western blot法。取各组小鼠肝组织约3mm3于液氮中研碎，加入蛋白裂解混合液于冰上充分裂解。以14 000/min离心3min后取上清液。按照BCA法进行总蛋白质浓度定量。加入5伊蛋白上样缓冲液，100益、5min裂解蛋白。制备十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），每孔加蛋白样品 3 0滋g，在 1 00V 电压及100min的湿转条件下将蛋白转至硝酸纤维素膜（NC膜）上，然后用含5豫脱脂奶粉PBS室温封闭4益过夜。一抗室温孵育2h，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1h，TBST缓冲液漂洗3次。使用ECL发光液显影，自动化学发光成像系统采集图片，ImageJ软件分析灰度值，计算目标蛋白相对表达量。

1.2.7 统计学处理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prime 7.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，方差齐时多组间比较采用F检验，两两比较采用LSD-t法，方差不齐时多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠体重、肝脏指数比较 结果显示，在第20周时与对照组相比，高脂+去势组小鼠体重及肝脏指数均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 3组小鼠体重及肝脏指数的比较

2.2 3组小鼠肝组织HE及油红O染色结果比较 与对照组比较，HE染色下高脂+去势组和去势组出现明显的肝细胞空泡样改变，组织炎症细胞浸润，呈典型肝脂肪变性表现；高脂+去势组病变程度更重，并可见静脉周围、肝窦轻度纤维化表现。油红O染色下见高脂+去势组广泛肝细胞质内大小不等红色脂滴聚积，呈典型肝脂肪变性表现。高脂+去势组脂肪变性、炎症坏死灶及气球样变更显著，NAS评分更高，并达到肝纤维化S0～S1级别。3组小鼠病理检查结果见图1（插页），NAS比较见表2，肝脏纤维化评分见表3。

表2 3组小鼠肝脏NAS比较

表3 3组小鼠肝脏纤维化比较

2.3 3组小鼠外周血清RBP4蛋白表达水平比较ELISA结果显示，对照组、去势组和高脂+去势组小鼠外周血清中RBP4蛋白表达水平分别为（7.65依0.48）、（8.70依1.67）和（13.57依1.67）mg/ml，差异有统计学意义（P＜0.01）；进一步两两比较发现，高脂+去势组血清RBP4蛋白表达水平明显高于另外两组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），而对照组与去势组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 3组小鼠肝组织中RBP4蛋白表达水平比较Westernblot结果显示，对照组、去势组和高脂+去势组小鼠肝组织中RBP4蛋白相对表达量分别为0.10依0.05、0.26依0.10 和 0.38依0.21，差异有统计学意义（P＜0.01）；进一步两两比较发现，高脂+去势组和去势组肝组织RBP4蛋白表达水平均明显高于对照组（均P＜0.01），而前两组之间表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

免疫组织化学结果显示，抗RBP4蛋白棕褐色免疫颗粒在肝细胞中特异性广泛表达，其他细胞类型包括胆管细胞、肝星状细胞、内皮细胞和炎症细胞中无表达，阳性染色位于肝细胞胞质。对照组、去势组和高脂+去势组小鼠肝组织中RBP4蛋白染色IOD值分别为41.22依6.51、93.76依10.02 和 286.93依35.33，3 者比较差异有明显统计学意义（P＜0.01）。去势组和高脂+去势组较对照组肝细胞RBP4蛋白表达水平明显上调，尤以高脂+去势组为著。RBP4蛋白表达水平与肝脏脂肪变程度呈一致性改变，见图3（插页）。

图2 3组小鼠肝组织RBP4蛋白电泳图

2.5 3组小鼠 FAS、SREBP-1c蛋白表达水平比较Western blot结果显示，对照组、去势组和高脂+去势组小鼠肝组织中SREBP-1c蛋白相对表达量分别为0.25依0.08、0.41依0.10 和 0.48依0.07，FAS 蛋白相对表达量分别为 0.37依0.07、0.69依0.13 和 0.75依0.11。SREBP-1c和 FAS蛋白在3组间差异有统计学意义（P＜0.01），进一步两两比较发现高脂+去势组和去势组SREBP-1c和FAS蛋白表达水平均明显高于对照组（均P＜0.01），但前两组之间差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图4。

图4 3组小鼠肝组织SREBP-1c和FAS蛋白电泳图

3 讨论

RBP4蛋白主要通过肝脏合成，其次是脂肪组织。近年来的研究认为血清RBP4蛋白参与胰岛素调控，与肥胖及糖尿病相关，并被认为具有2型糖尿病诊断标志物的价值[3，8]。但是RBP4蛋白表达水平与NAFLD的关系尚未明确[6，9]。本研究团队的前期研究发现绝经后NAFLD女性患者较健康对照者外周血清RBP4蛋白水平明显升高，具有NAFLD诊断标志物的价值，但缺乏组织学证据。在本实验中，笔者利用对雌性C57BL/6小鼠实施高脂饮食和去势手术的干预，成功模拟女性绝经后NAFLD疾病状态。结果显示，在去势雌性小鼠中，当肝脏出现轻度脂肪变性，即病理学检查中发现肝细胞脂质沉积增加，但尚无明显炎症反应时，即有肝RBP4蛋白表达上调，且其表达水平随着肝脂肪变性的程度加重而上升。表明肝脏RBP4蛋白水平不仅是NAFLD的敏感诊断指标，也能够在一定程度上反映NAFLD的疾病严重程度。进一步对比小鼠肝脏和外周血清RBP4蛋白表达水平，笔者发现RBP4蛋白在这两者中的表达改变呈一致性，提示血清RBP4蛋白能够较好地反应肝组织RBP4蛋白表达水平，由此认为血清RBP4蛋白水平亦能够较好地反映肝NAFLD的发生、发展情况。这一结果与前期临床研究结果一致，为血清RBP4蛋白具有在绝经后女性中NAFLD诊断标志物这一价值提供了可信证据。

Xia等[10]发现RBP4蛋白可特异性激活SREBP-1c并上调其下游基因FAS的表达，从而影响肝脏脂质合成代谢。SREBP-1c蛋白活化是肝细胞合成TG的关键步骤，激活的SREBP-1c蛋白可在转录水平调控FAS蛋白，后者是乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成内源性长链脂肪酸的关键酶。笔者观察到，脂肪变性的肝组织SREBP-1c和FAS蛋白表达水平均明显高于正常对照，与同一样本中RBP4蛋白表达改变一致；但随着肝脂肪变性的进一步加重，SREBP-1c和FAS蛋白的表达并未相应上调，呈现出与RBP4蛋白是分离趋势。提示NAFLD发病机制复杂，RBP4蛋白参与其中部分调控途径。

目前关于性激素与RBP4蛋白表达关系的研究较少，部分临床研究数据显示在男性中，睾酮水平与血清RBP4蛋白水平呈正相关[11-12]。Li等[13]的临床研究发现，肥胖女性人群中血清RBP4蛋白水平与雌激素浓度呈负相关。笔者前期研究发现无论是否肥胖，女性血清RBP4蛋白表达水平都与循环雌激素呈负相关[14]。这一现象在本实验中获得进一步证实。在同周龄小鼠中，去势小鼠肝脏和血清中RBP4蛋白水平均高于接受假手术的对照组，提示绝经状态可能上调女性RBP4蛋白的表达。但考虑到绝经状态涉及到多种性激素的改变，包括雌激素水平下降、睾酮水平相对上升等，因此尚不能明确单一激素改变对绝经后女性血清RBP4蛋白表达水平的调控作用，本研究团队将在进一步研究中探讨各性激素成分对RBP4蛋白调控的分子机制。

综上所述，RBP4蛋白在去势雌性小鼠模型NAFLD的发生和发展过程中表现出良好的肝脂肪变性病情的相关性。结合相关临床研究，血清RBP4蛋白可能成为绝经后女性NAFLD诊断标志物和治疗靶点，具有良好的应用前景。