程娟　潘天颖　吴郝娟　谢江　许文明

摘要：收集体外受精（in vitro fertilization，IVF）与自然受孕分娩儿童脐血和外周血，提取血清，采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平，并進行自闭症儿童行为量表（autism behavior checklist，ABC）评分，彩色多普勒超声对妊娠11周及21周的胎盘厚度进行测量，了解体外受精及自然受孕儿童神经行为发育的差异。结果显示，体外受精分娩儿童血清BDNF水平低于自然受孕儿童（P<0.01），ABC量表评分高于自然受孕儿童（P<0.05），孕21周胎盘厚度增厚（P<0.05）。这提示体外受精可能会影响胎盘发育，并导致儿童神经行为的改变。

关键词：脑源性神经营养因子;体外受精;胎盘厚度;ABC量表

中图分类号：R729

文献标志码：A

文章编号：1674–5124（2019）03–0065–04

A study of neurobehavioral development in children conceived by in vitro fertilization

CHENG Juan1，2， PAN Tianying3， WU Haojuan2， XIE Jiang1，2， XU Wenming3

（1. Clinical Medical College， Southwest Medical University， Luzhou 646000， China;2. The Third Peoples Hospital of Chengdu， Chengdu 610031， China;3. The Second Affiliated West China Hospital of Sichuan University， Chengdu 610041， China）

Abstract： The umbilical cord and peripheral blood of naturally conceived and in vitro fertilization （IVF） children were collected， then serum was extracted. All children were detected the serum brain-derived neurotrophic factor （BDNF） levels with the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.The neurobehaviour scores were evaluated with the autism behavior checklist （ABC）. Color Doppler Ultrasonography was used to measure the placenta thickness at 11 and 21 weeks of pregnancy. To understand the difference of neurobehavioral development between in vitro fertilization and natural conception. The results showed that serum BDNF level of in vitro fertilization children was lower than that of natural conception children （P<0.01）， ABC scale score was higher than that of natural conception children （P<0.05）， and placental thickness increased at 21 weeks of gestation （P<0.05）. This suggests that in vitro fertilization may affect placental development and lead to changes in neural behavior in children.

Keywords： brain-derived neurotrophic factor; in vitro fertilization; placental thickness; autism behavior checklist

0 引言

近年来，随着经济水平的提高及医学技术的进步，不孕患者接受体外受精（in vitro fertilization，IVF）技术的夫妇逐年增多，一般认为IVF技术是相对安全可靠的。然而，目前的动物研究已将某些不良的神经发育结局与体外受精联系起来，尽管针对人类的研究还没有定论。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在脑内合成并在中枢神经系统与外周神经系统均广泛存在和表达，其在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育以及突触可塑性、新突触形成等起重要作用[1-2]。BDNF分泌异常与各种神经和精神异常状况相关，已报道的有自闭症、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默氏症等[3-4]。许多脑发育异常相关疾病导致患者的脑和血清BDNF蛋白水平降低[5-6]。大量研究表明BDNF的水平变化可作为儿童神经发育相关疾病可靠的预测因子，如已有研究发现体外受精妇女早期循环BDNF水平降低与妊娠不良结局有关[7]，而具体原因不明确，推测体外受精子代儿童期BDNF水平会发生变化及其对神经行为发育产生一定的影响。

虽然体外受精后活产儿每年超过出生总数的1%，但对胎儿-胎盘-神经发育的影响尚不清楚。研究显示受孕方式对妊娠早期胎盘大小、质量无明显影响[8]，但体外受精的婴儿存在胎盘增生、出生体重较轻、胎盘早剥的风险[9]。体外受精导致胎盘DNA甲基化和参与神经元发育的基因表达改变，可能对健康和疾病产生长期影响，包括神经发育不良。本研究重点关注体外受精是否会导致胎盘厚度的改变，从而影响胎儿的大脑发育，并导致儿童神经行为的改变。

因此，本研究拟通过对体外受精儿童血清中BDNF水平及胎盘厚度进行定量分析，观察ABC量表得分情况，评估体外受精对胎盘发育及血清中BDNF水平与神经行为发育改变的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2008年1月至2011年12月在成都市妇女儿童中心医院，四川大学华西第二医院，生殖中心通过IVF技术成功受孕，并在四川大学华西第二医院产科分娩长大后3～8岁12例儿童作为IVF组，其中男8例，女4例;另随机抽取同期自然受孕在该院产科分娩儿童10例作为对照组，其中男5例，女5例。两组儿童在年龄（P=0.95）、性别（P=0.67）等一般资料比较差异均无显著性（P>0.05），具有可比性。

1.2 实验方法

1.2.1 试验仪器与材料

人血清BDNF蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒（R&D Systems，USA），试剂盒内包括：预包被96孔板、标准品、样本稀释液、带标记的检测抗体、洗涤缓冲液、显色剂A和B、终止液及封板膜。酶标仪（iMark Microplate Reader 12337，BIO-RAD，USA）;西门子公司Sequoia 512型彩色多普勒超声诊断仪;美国GE公司730型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率3.5MHz。自闭症儿童行为量表（Autism Behavior Checklist，ABC量表），包括57个描述自闭症儿童的感觉、行为、情绪、语言等方面异常表现的项目。

1.2.2 实验方法

用离心管收集胎儿分娩后脐血及受试儿童空腹静脉血液（晨血）4mL，室温（22～25°C）放置30～60min凝集，3000r/min离心10min，收集上清并保存于–20°C待测。采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）按照人血清BDNF蛋白测定试剂盒说明书进行检测。方法简述如下：设置标准孔、样本孔和空白孔，取10μL血清进行检测，37°C温育60min，手工洗板5次，依次加入显色剂A/B后恒温箱37°C避光孵育15min。每孔加入终止液后5min内在酶标仪450nm波长处测定各孔的光密度（optical density，OD）值。预实验板间，板内变异系数均<10%。以标准品浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，标准品线性回归与预期浓度相关系数R≥0.9900。正式实验前随机抽取8个样本，每个样本重复测试2次，两次测定结果差异无统计学意义，该部分结果不作为实验最终的分析结果。对所有的儿童采用自闭症儿童行为量表（autism behavior checklist，ABC）进行行为症状的评定。量表共包含57个问题，分别描述了儿童的感觉（S）、社会交往（R）、躯体运动（B）、语言（L）、生活自理能力（S）5大功能区，每个问题按1～4级评分，各项得分相加得总分，分数越高则表明自闭症行为越严重。

彩色多普勒超声测量孕11周及21周胎盘厚度，测量部位取胎盘中央最厚部从子面绒毛板至母体面的基底层。同一胎儿均重复测量2～3次以减少其测量误差。

1.3 统计分析

数据资料采用SPSS19.0软件进行统计分析，组间比较采用独立样本的t检验、χ2检验、F检验和Pearson相关检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 实验结果

两组儿童血清BDNF水平测定结果见图1，从该图可以看出IVF组儿童血清BDNF水平（1038.74±714.45）pg/mL低于对照组儿童（2000.16±578.73）pg/mL，差异有统计学意义（t=–3.418，P=0.003）;两组儿童脐血BDNF水平IVF组低于对照组（见图2），但差异无统计学意义（t=–4.99，P=0.623）。两组儿童ABC量表评分结果见图3，该图显示IVF组儿童评分22.58±22.35高于对照组儿童7.00±9.46，差异有统计学意义（t=2.191，P=0.044）。将血清BDNF水平和ABC量表评分进行Pearson相关检验，两者不存在相关关系（P>0.05）。

进一步对IVF孕妇在孕期的B超检查和其他生化指标进行分析，B超结果显示孕11周胎盘厚度（见图4）两组差异无统计学意义（t=0.13，P=0.99）;而孕21周胎盘厚度IVF组（3.48±0.45）cm较对照组（3.09±0.41）cm增厚（见图5），差异有统计学意义（t=2.223，P=0.036）。将胎盘厚度和血清BDNF水平及ABC量表评分进行Pearson相关检验，不存在相关关系（P>0.05）。

3 讨论

本研究以IVF和自然受孕儿童为研究对象，从血清BDNF水平、ABC量表评分和胎盘厚度方面探讨了它们之间的差异。结果表明，体外受精儿童胎盘增厚，血清中BDNF水平降低，出现与自闭症神经行为发育相关的量表评分升高的趋势。提示对于IVF儿童需要重点关注与自闭症相关的神经发育指标。

已有研究对体外受精出生儿童血清BDNF水平及认知和行为发育的认知并不一致。Ramer等[10]研究發现，体外受精周期开始前血清中BDNF水平的升高与子宫外植入有关，而宫内植入的妇女体内BDNF水平的小幅升高与随后的怀孕失败有关。体外受精早期血液循环中BDNF水平降低与妊娠不良结局有关[9]。Yeung等[11]报道体外受精与出生后第1年的不良认知和行为发育无关;但随着时间的推移，体外受精子代在年老时仍可能发展为神经发育缺陷[12]。Mainigi等[13]的研究结果也显示，体外受精的子代大脑皮层神经元密度下降，出现焦虑样行为。本课题组通过对体外受精出生3～8岁儿童血清检测发现BDNF水平降低而刚分娩时脐血BDNF水平无明显差异，同时ABC量表评分较高，体外受精儿童表现出异常行为，但究竟是BDNF水平对儿童神经发育产生影响还是体外受精本身会对神经行为发育造成影响有待进一步的研究。因此，仍需要继续对不同年龄阶段的儿童进行长期随访研究，找到针对性的治疗方法。

与自然受孕相比，体外受精后胎盘增生的发生率增加，本课题组通过对体外受精孕11周及21周胎盘厚度检测发现孕21周胎盘厚度增加，BDNF在妊娠期胎盘血管成熟过程中发挥重要作用，可促进滋养层细胞生长，调节胎盘和胎儿发育[14];目前尚无BDNF变化与胎盘厚度相关方面的确切研究，BDNF水平变化是否通过调节胎盘发育来影响后代神经行为发育有待进一步的探索。Yi等[15]研究发现BDNF基因在牛卵母细胞和体外受精胚胎不同阶段的mRNA水平不同，研究结果为神经营养素在促进早期胚胎发育以及通过共培养系统促进颗粒细胞生长方面的作用提供了证据，说明BDNF可以直接或间接促进牛早期胚胎发育，而目前人类体外受精后BDNF水平对胚胎及后代神经行为发育的影响尚需进一步研究。

4 结束语

本研究发现体外受精儿童胎盘增厚，血清中BDNF水平降低，子代出现与自闭症神经行为发育相关的量表评分升高的趋势。推测可能为体外受精通过BDNF水平影响胎盘-胎儿发育，脑功能受损，从而导致儿童神经行为的改变，可能会增加体外受精儿童患神经发育相关疾病如自闭症与抑郁等心理疾病的风险，这提示需要对体外受精后不同时期儿童长期神经发育监测相关的研究，对临床疾病的预测或预防具有参考价值。同时BDNF可作为一种潜在的预测神经发育类疾病风险的生物标志物，目前BDNF已被证实是一种重要的内源性神经保护因子，未来有望作为某些神经发育类疾病的治疗靶点。

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（編辑：莫婕）