燕平梅,李润花,赵文婧,陈燕飞

(1.太原师范学院 生物系,太原 030619; 2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，太原 030619)

发酵蔬菜在我国历史悠久，是经乳酸发酵制成的蔬菜腌渍品，因其易保藏、成本低、风味多样而备受人们的喜爱。泡菜中的主要发酵微生物是乳酸菌，对一些致病菌具有强烈的抵抗作用，可吸收白菜中的碳水化合物，并释放出酒精和二氧化碳，有效地抑制对肠道产生不利影响的腐败菌和致病菌[1-3]，减弱了有害菌对人体代谢的伤害，此外，还有帮助肠道消化，避免胆固醇含量过高等一系列对人体有益的医疗功效[4]。但亚硝酸盐总是不可避免地在泡菜制备过程中产生，若其含量超过一定值，轻者对人体造成轻微损害，重者危害生命。大部分人们食用的亚硝酸盐来源于蔬菜[5-8]，但由于在发酵过程的开始阶段硝酸盐还原菌活跃，能产生硝酸盐还原酶使硝酸盐还原为亚硝酸盐，因此发酵食品中亚硝酸盐含量比一般食品要高得多。亚硝酸盐能使高铁血红蛋白含量升高，导致氧无法被运输到体内需氧的部位[9-11]，体内氧循环不能正常进行，阻滞人体代谢造成全身发紫。

为降低发酵食品中的亚硝酸盐含量，降低食用泡菜给人体带来的伤害，本实验使用超声波杀菌技术以期达到预期效果。超声波是频率超过20000 Hz的声波，不能被人耳所感知[12]。人们对超声波在生物方面的作用研究不断深入，超声杀菌技术也不断发展，首先在发达国家字被普遍使用，逐渐传入中国，成为一种适用于食品杀菌且效果良好的技术并逐渐获得人们的青睐。采用超声波杀菌主要是应用其空化作用在细胞壁与细胞质间的局部部位形成很高的温度和压力[13]，使泡菜中的有害微生物的细胞壁被破坏，失去保护屏障，不能存活[14]。将超声杀菌技术应用于泡菜发酵的优点有灭菌效率高，未损害白菜本身，也不会在泡菜中加入其他风味，较好地将泡菜本身的营养留存，保持了泡菜的健康性和营养性。

当今泡菜发酵趋向多样化、疗效化、营养化、绿色化发展。为了使泡菜更加绿色健康，已有前辈在泡菜中加入维生素C、大蒜、白醋、白酒、葡萄糖、绵白糖、甚至中草药等改善泡菜品质[15-21]，减少其中亚硝酸盐含量，并都取得了一定的成果，但效果没有十分完善，在降低亚硝酸盐含量的同时，也不可避免地加入了泡菜本身没有的味道。超声杀菌技术既能杀灭有害菌，又不伤害泡菜本身，有利于保持白菜的风味，所以本实验期望利用该技术在减少发酵白菜中亚硝酸盐含量的同时，保留白菜本身的味道和营养，改善泡菜的品质。用不同时间超声波处理发酵白菜，探索适合发酵的最适时间，对泡菜食品工业未来的发展具有重要的建设意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白菜：选取颜色较浅的。NaNO2；无碘食盐；氨水；显色剂(对氨基苯磺酸与N-1-萘基乙二胺)；孟加拉红培养基；NA培养基；MRS固体培养基：购于Sigma-Aldrich化学试剂公司。

BILON92-ILDL超声波信号发生器 上海比朗仪器有限公司；UV-5100紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵蔬菜的制备

发酵容器使用250 mL的锥形瓶16个，棉塞用纱布包裹制成瓶盖，将三角瓶和棉塞一起在立式灭菌器中121 ℃灭菌20 min，冷却后，无菌条件下在每个锥形瓶中加入60 g用无菌水清洗的白菜和200 mL 4%煮沸后冷却的NaCl溶液，其中一组不用超声波处理，其余组用超声波信号发生器分别对泡菜进行5,15,30 min超声波处理，之后塞上棉塞，室温发酵。

1.2.2 取样

每5 d用不同时间超声波处理(5,15,30 min)的发酵白菜各2瓶测定指标，在超净工作台上用灭过菌的镊子夹出约2.5 g白菜作为样品，测定亚硝酸盐含量。用移液枪吸取1 mL发酵液，稀释合适倍数进行涂布。另外吸取5 mL发酵液用pH计测定pH。

1.2.3 亚硝酸盐的测定

亚硝酸盐含量根据梁文君等的方法进行测定。

1.2.4 pH的测定

从每个锥形瓶中取适量发酵液，用pH计测pH，重复3次，分析及处理数据即可。

1.2.5 亚硝酸盐生成细菌的分离和计数

使用SAN(sulfanilamide nitrate)琼脂重层法。(SAN琼脂：葡萄糖0.5 g，硝酸钠1.0 g，对氨基苯磺酸0.2 g，琼脂2.0 g，蒸馏水100 mL)。

将吸取的1 mL发酵液稀释108后在细菌培养基上涂布，培养1 d后，在形成细菌菌落的培养基上盖上约15 mL的SAN琼脂培养基，凝固后于30 ℃培养箱静置15 min，在培养基表面注入约1 mL 0.1% NEDA(N-1-萘二胺二氢氯化物/2N盐酸溶液)，亚硝酸盐生成菌的菌落及菌落周边会变红，平板计数法计数即为亚硝酸盐生成菌数量。

1.2.6 发酵白菜中微生物乳酸菌的计数

在超净台中，将制备好的MRS培养基上涂布0.1 mL稀释的泡菜液(108)，30 ℃倒置培养2 d，用分区的方式记录数据。

1.2.7 发酵白菜中细菌的计数

在超净台中，将制备好的牛肉膏蛋白胨培养基上涂布0.1 mL稀释的泡菜液(108)，37 ℃倒置培养1 d，用分区的方式记录数据。

1.2.8 发酵白菜中酵母菌的计数

在超净台中，将制备好的虎红培养基上涂布0.1 mL稀释的泡菜液(102)，28 ℃倒置培养4 d，用分区的方式记录数据。

1.2.9 感官指标的测定

按表1的评分标准评分，请10人评分，记录数据。

表1 泡菜发酵产品的感官指标评分标准

1.3 统计分析试验结果

试验结果为3组重复试验数据的平均值，用统计分析软件SPSS 22进行Duncan法单因素方差分析。

2 结果分析

2.1 不同时间超声波处理对发酵白菜亚硝酸盐含量的影响

表2 发酵白菜中亚硝酸盐含量

续 表

注：表中数据为平均值±标准误差，不同字母代表不同处理间显著性差异(P<0.05),下同。

由表2可知，从泡菜发酵的时间来看，第5,10,15,20天泡菜体系中的亚硝酸盐含量均为超声波处理实验组显著低于对照组。不同时间超声波处理对亚硝酸盐含量的影响不同，15 min超声波处理的泡菜亚硝酸盐含量最低，与对照组的差异极显著(P<0.01)，5，30 min处理组的亚硝酸盐含量低于对照组，与对照组相比差异显著(P<0.05)，效果次于15 min。

2.2 不同时间超声波处理对发酵白菜pH的影响

表3 发酵白菜的pH

由表3可知，发酵白菜的pH随着时间的延长逐渐下降，达到一定酸度便会保持平衡。发酵5 d， pH下降，到15 d， pH趋于稳定。在不同时间超声波处理的泡菜中，15 min超声波处理的pH下降程度最高也最快，经过统计分析证明15 min处理的pH显著低于其他组(P<0.05)。

2.3 不同时间超声波处理对发酵白菜中亚硝酸盐生成菌数量的影响

表4 发酵白菜中亚硝酸盐生成菌数量

由表4可知，从泡菜发酵的时间来看，第5，10，15，20天泡菜体系中的亚硝酸盐生成菌的数量均为超声波处理实验组显著低于对照组。不同时间超声波处理对亚硝酸盐生成菌数量的影响不同，15 min超声波处理的发酵白菜亚硝酸生成菌数目最低，与对照组差异极显著(P<0.01)，降低程度也较5，30 min明显，可见这组处理对亚硝酸盐生成菌的抑制作用最好。

2.4 不同时间超声波处理对发酵泡菜乳酸菌数量的影响

从泡菜发酵的时间来看，第5，10，15天泡菜乳酸菌数量显著升高，到第20天显著性又降低，而且第15天乳酸菌数量显著高于其他时间，15 min的乳酸菌数量最高，即超声波处理15 min的泡菜最好，见表5。

表5 泡菜发酵液中乳酸菌数量的变化

从超声波处理时间可以看出，超声波处理15，5 min的泡菜乳酸菌数量极显著高于对照组(P<0.01)，而30 min极显著低于对照组(P<0.01)，第15天乳酸菌数量最高，说明第15天的泡菜比较适合食用。

2.5 不同时间超声波处理对发酵泡菜细菌数量的影响

从泡菜发酵的时间来看，第5，10，15天泡菜细菌数量显著降低，到第20 d显著性又增加，而且第15天细菌数量显著低于其他发酵时间，说明超声波处理15 min的泡菜最好，见表6。

表6 泡菜发酵液中细菌数量

从超声波处理时间可以看出，超声波处理时间为15，5，30 min的泡菜发酵产品的细菌数量显著低于对照组，并且15 min的处理组最显著，说明泡菜在第15天比较适合食用。

2.6 不同时间超声波处理对发酵泡菜酵母菌数量的影响

从泡菜发酵的时间来看，第5，10，15天泡菜酵母菌数量显著升高，到第20天显著性又降低，而且第15天酵母菌数量显著性高于其他发酵时间，说明超声波处理15 min的泡菜最好，见表7。

表7 泡菜发酵液中酵母菌数量的变化

从超声波处理时间可以看出，超声波处理15 min的泡菜酵母菌数量极显著高于对照组，而5，30 min极显著低于对照组。酵母菌数量是评价泡菜风味的重要指标之一，第15天酵母菌数量最高，说明第15天的泡菜比较适合食用。

2.7 不同时间超声波处理对发酵泡菜感官品质的影响

从泡菜发酵的时间来看，第5，10，15天泡菜感官评分显著增加，到第20天显著性降低。第15天评分显著性高于其他时间，说明第15天的泡菜比较适合食用，而且第15天的泡菜香气正、口感、咀嚼感与其他时间相比最好，适合食用，见表8。

表8 泡菜发酵产品的感官指标评分

从超声波处理时间可以看出，超声波处理5，15 min的泡菜感官品质评分极显著高于对照组，而30 min则低于对照组。15 min的分数最高说明超声波处理15 min的泡菜是最好的，而且其泡菜颜色均匀、菜汤清亮、香气比较正、酸甜，口感、咀嚼感都比较好，很适合食用。

3 讨论

由于制备泡菜时蔬菜未经过灭菌，蔬菜中的多种微生物共同生存，在泡菜发酵初期，蔬菜表面所带微生物在发酵体系处于优势，不含硝酸盐还原酶的乳酸菌生长代谢不旺盛，此阶段产生亚硝酸盐的主要菌落是蔬菜中携带的杂菌如大肠杆菌、假单胞子菌等硝酸还原菌[22]。本研究利用超声波的杀菌功能旨在抑制泡菜发酵初期的杂菌，尤其是抑制亚硝酸盐生成菌。由实验结果可知，超声波处理后，泡菜体系细菌和亚硝酸盐生成菌数量较对照显著减少。

朱绍华[23]利用超声波对酱油进行灭菌实验，处理10 min后,灭菌率为75%。梁蕊芳等[24]通过研究超声波对食品污染性菌种的破碎效果发现细菌对超声波处理敏感，破碎率达96%，而真菌对其不敏感，破碎率较低。由实验结果可知，超声波处理后，泡菜体系细菌数量显著减少，而酵母菌数量先增加之后降低。

就超声波处理时间而言，从本实验数据可以看出，在一定范围内，超声波杀菌效果与超声波处理时间成正比，即杀菌率随超声波处理时间的增长而提升，但处理时间过长，杀菌率将下降。张弛等人的研究表明[25]，超声波频率一定时，声波膨胀时间缩短，并且微小气泡没有足够的时间生长到可以产生空化效应的程度，或者气泡大小适宜但是未到破裂的时间，无法破裂。超声波作用时会产生空化效应和热效应，使得小气泡在坍塌时会产生高温、高压，使得细菌等微生物的细胞壁或细胞核被破坏。本实验中当超声波处理时间为10 min时，由于超声波处理时间太短，虽然气泡生长到足够的大小，但处于压缩相的时间不足，气泡来不及破裂，所以无法产生高热高压来破坏细胞，而且对植物细胞壁以及细菌细胞壁破坏很小，因此此时的泡菜质感比较脆，而且口感也比较好，菌的相对含量较高，这也与张弛等人的研究结果一致；进一步研究证明，一定的超声波处理时间使得细菌细胞壁通透性增大恰到好处，使其能够很好地生长，但时间太长会破坏细胞的细胞壁，使得细胞无法完成自我修复。所以，本实验中随着超声波处理时间的延长至15 min时，空化效应所形成的小气泡有足够的时间形成并破裂，从而使得微生物细胞膜局部变薄，通透性也增大恰到好处，使得细胞膜两侧的物质交换率增加，有利于菌体的大量繁殖，特别是乳酸菌、酵母菌，乳酸菌大量繁殖使得泡菜的品质、风味变得更好，所以此时的泡菜口感等是最好的。当处理时间延长至30 min时，由于处理时间过长，细菌的细胞壁被破坏，细胞无法完成自我修复，细胞死亡，所以相应的菌数量有所下降，再者超声波处理时间太长，破坏细胞壁组分，所以30 min泡菜细胞壁变软，口感、弹性也有所下降。

食品经过非热杀菌技术处理后，主要结构物质仍保持其正常的三维结构，执行正常的生理功能，所以能较好地保存其营养性[26]，超声处理过程并未伴随温度的升高，属于冷杀菌技术，因此不会使蔬菜中的营养物质结构改变，能较好地保留泡菜的营养，维持发酵白菜的品质和风味，是一种适用于食品杀菌且效果优良的杀菌技术。

4 结论

本实验旨在研究能降低发酵白菜亚硝酸盐含量的最适宜的超声波处理时间，并对不同发酵时间、超声波处理时间的亚硝酸盐含量、亚硝酸盐生成菌落数、pH进行数据分析，15 d后，15 min超声波处理条件下，亚硝酸盐生成菌为9.12 log CFU/mL，亚硝酸盐含量为3.10 mg/kg，pH低至4.28，对亚硝酸盐的抑制效果最好，最适合发酵。

超声波处理15，5 min的泡菜在第15天感官品质评分分别为96，86分，均显著高于对照组(83分)，而30 min(78分)则低于对照组；超声波处理15，5 min的泡菜在第15天乳酸菌数量分别为10.54，10.39 log CFU/mL，均显著高于对照组的10.37 log CFU/mL，而30 min(10.11 log CFU/mL)显著低于对照组。