李莹　王英　罗浩虹　吴娟英

【摘 要】目的：探索冻存复苏及4℃存放对细胞活性的影响。方法：培养细胞，冻存复苏后，利用台盼蓝染色和MTT法检测细胞的活性。结果：台盼蓝染色显示，未冻存的活力平均为96.57±1.21（%），而冻存细胞的细胞活力平均为74.29±2.14（%），两组有显著性差异（P<0.01）。4℃保存的细胞存放超过3h以上（第4h开始），细胞的存活显著降低。两组细胞之间的吸光度也出现同样趋势。

结论：细胞在4℃保存，3h内可保持活力不变。

【关键词】成纤维;台盼蓝;MTT

中图分类号： R114 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）29-0210-001

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.29.099

随着生物及细胞类制剂的增多，细胞在越来越多方面应用，而细胞的存放往往限制了细胞的应用。成纤维细胞是临床常用的一种细胞，可以促进细胞表皮迁移、增殖和分化[1]，培养方法相对成熟，性状稳定，存活能力强，是细胞制剂中的种子细胞。本实验以小鼠成纤维细胞为研究对象，初步确定了复苏后以及4℃保存状态下的细胞状态，为细胞的临床使用提供了依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

主要试剂：IMDM培养基，PBS（pH=7.4），胎牛血清，L-谷氨酰胺，青链霉素抗生素，0.25%胰蛋白酶（invitrogen，美国），多聚赖氨酸（sigma，美国），0.5%MTT溶液、20%SDS，台盼蓝试剂（sigma，美国）。

主要仪器：CO2培养箱（Thermo，德国）、低速离心机、6孔培养板、96孔培养板（Corning，美国），倒置显微镜（Olympus，日本）、酶标分析仪、超净工作台（苏净集团安泰公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 成纖维细胞的制备

取无菌条件下的小鼠皮肤组织2块，分离真皮，剪成小块，加0.25%胰蛋白酶反复吹打消化，用含血清的DMEM/F12培养基清洗，离心1200r/min，8min，弃上清，按1×105/ml细胞浓度加10%牛血清DMEM/F12培养液培养。待细胞贴壁，据细胞生长情况传代和换液。

1.2.2 细胞的冻存

收集培养好的细胞，加入细胞冻存液（5%DMSO+45%胎牛血清），采用梯度降温法冻存：现象细胞置于4℃冰箱内放置1h，-20℃冰箱内放置2h，-80℃超低温冷冻过夜，最后置于液氮中保存。

1.2.3 冻存后复苏

取冻存3个月的细胞，37℃水浴，快速解冻，离心洗涤后备用。

1.2.4 台盼蓝染色

将新鲜培养的成纤维细胞与复苏后的细胞悬液分别与3μL 0.4%的台盼蓝染液混合，取少许混合液置于血细胞计数板的计数池，于普通显微镜下记录计数板4个大方格内的总细胞数和死细胞数。另取一组细胞，按时间（时间间隔为1h）依次取出细胞悬液加培养液至1ml，混匀，取其中的90μL细胞悬液与10μL 0.4%的台盼蓝染液混合，取少许混合液充至血细胞计数板的计数池，1min内读数，于普通显微镜下记录计数板内四个大方格内的总细胞数和死细胞数，胞核蓝染者为死细胞。分别计算细胞存活率。

1.2.5 MTT染色

分别将上述细胞的细胞悬液混合均匀，培养于96孔培养板，每孔100ml，置于37℃，5%的CO2恒温培养箱孵育，3-4d后按顺序加入10μL 0.5%的MTT溶液，继续孵育培养6-8h后，细胞内会产生蓝色结晶;加入10μL 20%的SDS，继续孵育过夜，使结晶溶解，取出用酶标仪570nm比色，读取各组吸光度值，算取平均值为横坐标，时间为纵坐标绘制折线图。

1.3 统计学处理

各组计量资料统计学处理采用SAS软件（9.0版本）行t检验。

2 结果

2.1 台盼蓝染色

细胞经台盼蓝染色后，普通显微镜下可见活细胞的胞质和胞核透亮，死细胞核蓝染。未冻存的细胞活力平均为96.57±1.21（%），而冻存细胞的细胞活力平均为74.29±2.14（%），两组有显著性差异（P<0.01）。将4℃存放的细胞分别进行细胞计数可见，4℃保存3h以内，细胞的存活率无显著性差异（P>0.05），而存放超过3h以上（第4h开始），细胞的存活率有显著性差异（P<0.05）。

2.2 MTT染色

活细胞中的琥珀酸脱氧酶可使MTT分解产生蓝色结晶状甲瓒颗粒，聚集于细胞内或其周围，其吸光度值与细胞数呈正比，间接反应细胞的增殖活性。实验结果显示，4℃保存的细胞，在3h以内的各组细胞吸光值之间无显著性差异（P>0.05），4h后各组的细胞吸光值之间有显著性差异，并有明显的下降趋势。

3 讨论

细胞属于生物制品，因此在临床应用中的使用不像药品，需要注意存放的温度，存放时间等。在本文的实验研究中，我们着重解决了两个问题，一是冻存细胞复苏后的细胞存活率问题，二是用于临床的细胞在4℃存放的最长有效时间问题。细胞的冻存及复苏是细胞实验中遇到的常规问题。由于组织的取材受时间地点等因素的限制，加之细胞的培养需要一定的时间，培养好的细胞不一定马上应用于临床，因此常将细胞低温冻存。成纤维细胞的冻存方法较多，目的是尽量减少冻存后对细胞的损伤。保护剂的选择、温度的控制及冷冻程序等的不同都会影响细胞复苏后的存活率、活性及克隆形成。现已证实，液氮冻存比-80℃冰箱的冻存效果好[2]。在本次实验中，我们采用5%DMSO+45%胎牛血清的冻存液，确保最佳冻存效果[3]。实验结果显示，冻存复苏后细胞的细胞存活率及细胞活力较未冻存细胞均有显著性差异，说明液氮冻存对细胞的确存在损伤，但复苏后的细胞存活率仍可达到70%左右，而4℃保存3h以内，细胞活力不变。

【参考文献】

[1]陈渴，张会波.原代人尿道狭窄成纤维细胞的体外培养及鉴定[J].检验医学与临床，2019，14（5）：1225-1227.

[2]游小燕，何琦琳，刘雪芹，等.一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究[J].基因组学与应用生物学，2019，25（1）：69-73.

[3]白艳艳，缪竞诚，张占英，等.不同冻存方法对脐血造血细胞的影响[J].苏州大学学报（医学版）2004;24（6）：839-840.