李莹　王英　罗浩虹　吴娟英

【摘 要】目的：探索冻存复苏及4℃存放对细胞活性的影响。方法：培养细胞，冻存复苏后，利用台盼蓝染色和MTT法检测细胞的活性。结果：台盼蓝染色显示，未冻存的活力平均为96.57±1.21（%），而冻存细胞的细胞活力平均为74.29±2.14（%），两组有显著性差异（P<0.01）。4℃保存的细胞存放超过3h以上（第4h开始），细胞的存活显著降低。两组细胞之间的吸光度也出现同样趋势。

结论：细胞在4℃保存，3h内可保持活力不变。

【关键词】成纤维;台盼蓝;MTT

中图分类号： R114 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）29-0210-001

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.29.099

随着生物及细胞类制剂的增多，细胞在越来越多方面应用，而细胞的存放往往限制了细胞的应用。成纤维细胞是临床常用的一种细胞，可以促进细胞表皮迁移、增殖和分化[1]，培养方法相对成熟，性状稳定，存活能力强，是细胞制剂中的种子细胞。本实验以小鼠成纤维细胞为研究对象，初步确定了复苏后以及4℃保存状态下的细胞状态，为细胞的临床使用提供了依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

主要试剂：IMDM培养基，PBS（pH=7.4），胎牛血清，L-谷氨酰胺，青链霉素抗生素，0.25%胰蛋白酶（invitrogen，美国），多聚赖氨酸（sigma，美国），0.5%MTT溶液、20%SDS，台盼蓝试剂（sigma，美国）。

主要仪器：CO2培养箱（Thermo，德国）、低速离心机、6孔培养板、96孔培养板（Corning，美国），倒置显微镜（Olympus，日本）、酶标分析仪、超净工作台（苏净集团安泰公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 成纖维细胞的制备

取无菌条件下的小鼠皮肤组织2块，分离真皮，剪成小块，加0.25%胰蛋白酶反复吹打消化，用含血清的DMEM/F12培养基清洗，离心1200r/min，8min，弃上清，按1×105/ml细胞浓度加10%牛血清DMEM/F12培养液培养。待细胞贴壁，据细胞生长情况传代和换液。

1.2.2 细胞的冻存

收集培养好的细胞，加入细胞冻存液（5%DMSO+45%胎牛血清），采用梯度降温法冻存：现象细胞置于4℃冰箱内放置1h，-20℃冰箱内放置2h，-80℃超低温冷冻过夜，最后置于液氮中保存。……