彭建， 吴兆颖， 刘巍巍， 赵海， 朱贵明， 曾柱1,**

(1.贵州医科大学 医药生物技术工程研究中心， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院 现代病原生物学特色重点实验室, 贵州 贵阳 550025； 4.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是导致医院感染的主要机会性致病菌之一[1]，会引发如呼吸道系统感染、败血症、手术切口感染、泌尿生殖道感染、获得性肺炎和继发性脑膜炎等感染或炎症[2-4]，发生这类感染的重症患者，感染后死亡率高于35%[1]。中国细菌耐药监测结果显示，各医院分离的AB对亚胺培南的平均耐药率已达到70.5%[5]，可见抗AB感染治疗形势十分严峻。抗菌肽又称为抗微生物肽，是生物机体天然免疫系统的重要组成部分[6-7]，相较于其他抗菌药物具有来源广、作用机制特别、抑菌效果好、不易产生耐药性等优势[8-9]，但也存在天然提取收集难、化学合成成本高、大规模生产成药技术不成熟的缺点[10]。本课题组前期从家蝇转录组测序结果中筛选得到一个新天蚕素分子Cecropin4(Cec4)、并成功化学合成，且证实了家蝇抗菌肽Cec4在体外对AB具有较好的抗菌活性[11]。虽然临床上多数感染只用一种抗生素就能控制，但面对多重感染或者耐药性较强的细菌，常常采取联合用药的方式[12-14]，抗菌肽与抗生素的联合使用不仅能提高治疗效果，减少单一抗菌药物的使用量，还能减少耐药菌株的出现几率[15-16]。因而，本研究旨在通过抗菌肽Cec4分别与3种临床常用抗AB类抗生素进行体外联合药敏试验，探究抗菌肽和抗生素体外联合作用于AB的效果及药效关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1受试菌株 标准AB(ATCC19606)保存于贵州医科大学病原生物学重点实验室，多重耐药AB(检验号4367661)、泛耐药AB(检验号4367992)均来自贵州某三甲医院，三株菌株均用25%甘油重悬，于-80 ℃暗处保存。

1.1.2主要药物和试剂 抗菌肽Cecropin4委托吉尔生化(上海)有限公司采用固相化学合成法合成，纯度(HPLC)>95%。注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(SCF)购自辉瑞制药有限公司，注射用亚胺培南西司他丁钠(IMP)购自美国默沙东制药公司，注射用硫酸多黏菌素B购自Biosharp公司，Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基和Luria-bertani(LB)固体培养基均购自索莱宝公司。

1.1.3主要仪器 单面垂直流超净工作台(苏州净化设备有限公司)，数显不锈钢电热培养箱(上海博讯实业)，隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，Millipore 0.22 μm微孔滤器(美国)，PB203-E型电子精密天平(上海梅特勒托利多仪器公司)，Milli-Q超纯水仪(法国Millipore PHarmacia公司)，高压灭菌锅(日本ALR)，超低温冰箱(日本三洋公司)，96孔平板(Biosharp)，麦氏比浊仪(上海昕瑞公司)，微量加样器(德国Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1抗菌肽Cec4及3种抗生素分别对AB的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)测定 根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法[17]测定抗菌肽Cec4、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(SCF)、注射用亚胺培南西司他丁钠(IMP)和注射用硫酸多黏菌素B单用时对AB的MIC。将抗菌肽Cec4和SCF、IMP及PB干粉分别配制终浓度为10、100、100及10 g/L的储备液，并将抗菌肽Cec4和抗生素双倍比稀释为不同质量浓度的液体，于-80 ℃保存备用。用MH培养基将复苏并过夜培养至对数生长期的3株AB菌悬液浓度调整为1.5×108CFU/L。设置抗菌肽Cec4、SCF、IMP为实验组、多黏菌素B为阳性对照组、培养基为阴性对照组，在96孔板中加入同浓度的菌液和不同质量浓度抗菌肽/抗生素，于37 ℃，120 r/min培养24 h。结果根据CLSI推荐的液体稀释法的判定标准，MIC值为肉眼未见细菌生长所对应的抗菌肽/抗生素浓度，之后各取0.01 mL样本液涂布在LB固体平板上，于37 ℃静置培养18～24 h，无细菌生长所对应的抗菌肽/抗生素浓度为最小杀菌浓度(MBC)，用以验证MIC的准确性。

1.2.2抗菌肽Cec4与3种抗生素对AB的联合药敏试验 参照文献[18]方法改进，采用肉汤稀释棋盘法进行试验。选取7×7棋盘，抗菌肽/抗生素药液的制备与测定MIC时所用的方法一致。根据测得的每种药物单用对每种菌株的MIC，将所有药物的最高浓度设定为MIC的2倍，然后均用无菌蒸馏水对其进行一系列双倍比稀释。用1.2.1的方法制备细菌悬液，以抗菌肽Cec4和SCF联合使用作用于标准AB为例，SCF以横列方式排布，抗菌肽Cec4以纵列方式排布，每孔中不同浓度的抗菌肽/抗生素药液共计0.1 mL，然后每孔中再加入菌悬液0.1 mL。当96孔板中的每一横行抗菌肽Cec4浓度保持不变时，SCF浓度依次为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16及0倍MIC；当每一纵列孔中SCF浓度保持不变时，Cec4浓度依次为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16及0倍MIC。将96孔板振荡均匀后放在湿盒中，于37 ℃下静置培养18 h。

1.2.3联合用药效果判定 部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index, FIC index)是抗菌药药效学参数之一，FIC index=[MIC(a)/MICa] +[MIC(b)/MICb]，其中MIC(a)和MIC(b)分别代表a药和b药联合用药时各自的MIC值，MICa和MICb分别代表a药和b药单用时的MIC值。当FIC index≤0.5时，药物a和b之间有协同抗菌作用；当0.52.0时，则认为药物a和b之间有拮抗作用，且2种药物联合使用的效果显著低于其中一种药物单独使用的效果。各组实验均重复3次。

2 结果

2.1 抗菌肽Cec4及3种抗生素对AB体外的抗菌活性

抗菌肽Cec4对标准、多重耐药和泛耐药AB的MIC均为4 mg/L，而SCF和IMP对标准AB的MIC均是抗菌肽Cec4的4倍，SCF和IMP对多重耐药AB的MIC均为抗菌肽Cec4的16倍，对泛耐药AB的MIC也都是抗菌肽Cec4的8倍，说明AB对抗菌肽Cec4比对SCF、IMP抗生素更敏感；PB对3株AB的抑菌活性均较好，MIC为0.625 mg/L(表1)。

表1 抗菌肽Cec4及3种抗菌药对AB的MIC

2.2 抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联合使用对3株AB的药敏试验

2.2.1对标准AB的药敏试验 抗菌肽Cec4分别与SCF、IMP联合作用于标准AB时，FIC index在0.75～1.00，均表现为相加作用。Cec4与PB联合作用于标准AB时，Cec4对标准AB的MIC降至1 mg/L，PB对标准AB的MIC降至0.156 mg/L，Cec4和PB联用时的MIC均为单用时的1/4，抑菌效果增强，其FIC index为0.50，表现为协同作用(表2)。

表2 抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联用对标准AB药敏试验结果

2.2.2对多重耐药AB的药敏试验 抗菌肽Cec4与SCF联用时，FIC index是1；抗菌肽Cec4与IMP联用时，Cec4的MIC降至0.5 mg/L，IMP的MIC降至单用时的1/2、FIC index为0.625；抗菌肽Cec4与PB联用时，Cec4的MIC降至0.5 mg/L，PB的MIC降至0.312 mg/L，是单用时的1/2，抑菌效果增强， FIC index为0.625。因此，抗菌肽Cec4与这3种抗生素联合使用时均表现为相加作用(表3)。

表3 抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联用对多重耐药AB的药敏试验

2.2.3对泛耐药AB的药敏试验 抗菌肽Cec4分别与SCF、IMP联用时，抗菌肽和这2种抗生素的MIC均降为单用时MIC的1/2，抗菌效果增强；抗菌肽Cec4与PB联用时，Cec4对泛耐药AB的MIC为2 mg/L，是单用时的1/2，而PB对泛耐药AB的MIC变为单用时的1/8，表明泛耐药AB对Cec4和PB的敏感性均增强，FIC index为0.625。此试验说明抗菌肽Cec4分别与这3种抗生素联合作用于泛耐药AB时，均表现为相加作用(表4)。

表4 抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联用对泛耐药AB的药敏试验

3 讨论

碳青霉烯类药物在过去10年中被认为是治疗革兰阴性耐药菌感染的最后一道防线。近年来，碳青霉烯类AB检出率快速上升，已成为当前临床抗感染治疗面临的巨大难题。传统抗生素抗菌机制主要是针对细菌代谢通路或特定靶点，极易产生耐药。因此，寻找新的抗菌策略成为亟待解决的问题[19-20]。由于抗菌肽主要是通过静电力与细胞膜或者细胞内物质相互作用，具有广谱抗菌能力，因而抗菌肽受到科研人员的广泛关注[21]。前期研究表明抗菌肽Cec4在体外对AB的MIC仅为4 mg/L，远低于目前研究较多的抗菌肽LL-37在体外对AB的MIC[22]，说明AB对抗菌肽Cec4具有较高的敏感性。

在本研究中，抗菌肽Cec4单用时对AB的MIC均小于注射用SCF、IMP这2种抗生素，抗菌肽Cec4的抑菌效果较强。在联合用药试验中，抗菌肽Cec4与PB联合作用于标准AB时，抗菌肽Cec4的MIC值为单用时的1/4，多黏菌素B的MIC也仅为单用时的1/4，抗菌能力明显增强，FIC index为0.50，表现为协同作用；抗菌肽Cec4和SCF联合作用于标准AB时，FIC index为1.00，表现为相加作用，和IMP联合作用于标准AB时表现为相加作用，FIC index是0.75。SCF和IMP单用时对多重耐药AB的MIC均高达64 mg/L，对泛耐药AB的MIC为32 mg/L，这2株AB对这两种抗生素均表现出耐药[23]。但当抗菌肽Cec4与这两种抗生素联合作用于多重耐药和泛耐药AB时，这两种抗生素的MIC均为单用时最小抑菌浓度的1/2，表现为相加作用，敏感性增强，由此可推断Cec4联合抗生素使用可以有效清除该类耐药细菌。此外，抗菌肽Cec4在分别与SCF、IMP和PB联合作用于多重耐药AB时，FIC index范围为0.625～1.000，均表现出相加抗菌作用。已有研究表明大蒜素联合两种临床抗菌药物作用于多重耐药AB[24]时的FIC index范围为0.31～1.50，其中23.3%表现为无关作用。因此，本实验的联合用药效果更为明显，说明抗菌肽与传统抗生素联用有较好的临床前景。

综上，由于抗菌肽Cec4对临床常见的革兰阴性菌具有良好的抗菌效果，与3种临床常用抗革兰阴性菌抗生素联用呈相加、协同抑菌作用，抗菌肽与传统抗生素联合用药有望降低临床抗菌药用量、毒副反应及细菌的耐药性。