贺文煜，张海明，袁昌劲

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，全球胃癌一半以上均发生在中国，其发病率和死亡率仅次于肺癌，居第2位［1］。由于绝大多数胃癌确诊时已是中晚期［2］，化疗成为中晚期和进展期胃癌主要的治疗手段。但是传统化疗效果并不理想，超过70%患者总体生存率低于1年，5年生存率低于5%［3］。针对血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的小分子抑制剂阿帕替尼，可以特异性阻断VEGFR2的ATP结合位点，从而抑制肿瘤血管的生成和细胞的增殖［4］。研究显示，阿帕替尼可以显著提高中晚期胃癌患者生存率，对二线化疗失败的患者依然展现了明显的优势［5］。但是随着阿帕替尼的广泛使用，部分患者会出现阿帕替尼原发性耐药或继发性耐药，进而影响中晚期胃癌的疗效。

高良姜素（Galangin，GLA）是从姜科植物高良姜中提取的一种黄酮类化合物，药理学证实其具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物活性［6］，在乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤中展现出显著的抗癌活性［7］。但是GLA联合阿帕替尼对肿瘤细胞的抑制作用尚少见报道。本研究拟从细胞生物学行为角度出发，探讨GLA能否增强阿帕替尼对胃癌细胞的抑制作用以及相关机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海细胞生物所；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；阿帕替尼购自江苏恒瑞医药股份有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、凋亡检测试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司；Matrigel胶和Transwell小室购自美国BD公司；BCA蛋白定量试剂盒、胰蛋白酶（0.25%）、RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B（Akt）、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（p-Akt）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）单克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；兔抗人p38、p-p38、GAPDH单克隆抗体购自美国Sigma公司。

1.2实验前处理 细胞培养传代于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素+链霉素）的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2、37℃培养箱。每隔24～48 h更换1次培养液，培养48～72 h传代1次。将GLA溶于DMSO溶液，配制成终浓度为0、10、20、40、80、160 mg/L的溶液；将阿帕替尼溶于DMSO溶液，配制成终浓度为0、5、10、15、20、25、30 mg/L的溶液；配制好的溶液置于4℃冰箱保存用于后续实验（0 mg/L溶液为空白对照组，不加任何药物，仅加等体积DMSO溶液）。

1.3MTT法检测细胞增殖 收集对数生长期细胞，接种于96孔板（4×103个/孔），再加入RPMI-1640完全培养基使之终体积为100µL。继续培养24 h，分别加入终浓度为0、100、200、300、400、500、600 mg/L GLA溶液和终浓度为0、5、10、15、20、25、30 mg/L阿帕替尼溶液。每组设置4个复孔，药物作用48 h后向每孔中加入10µL MTT溶液，37℃孵育1.5 h后终止实验，利用酶标仪检测各孔490 nm处的吸光度（A）值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，接种于6孔板，待细胞75%融合时，弃去培养基，加入相应浓度的高良姜素和阿帕替尼，继续培养24 h。收集上清液，PBS冲洗3遍，加入胰蛋白酶消化细胞；再将消化的细胞和贴壁细胞一并收集，加入冰PBS冲洗3遍，再加入500µL结合缓冲液重悬细胞。加入5µL Annexin-V-FITC，避光室温孵育15 min，再加入5µL PI孵育5 min，于1 h内上机检测。

1.5细胞划痕实验检测细胞迁移 将胃癌SGC-7901细胞接种于12孔板，待细胞60%～70%融合时，弃去培养基饥饿12 h，用200µL移液枪枪头在培养板下划痕，PBS冲洗3遍，再加入适宜浓度的高良姜素、阿帕替尼和新鲜培养基，分别于划痕时和培养24 h时对划痕线拍照，并计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0时边缘距离-24 h时边缘距离）/0时边缘距离×100%。

1.6Transwell小室检测细胞侵袭能力 用不含血清的RPMI-1640培养基按照1∶20稀释Matrigel胶，向Transwell上室中加入60µL稀释后Matrigel胶，37℃培养箱放置6 h。首先用不含血清的培养基水化上室1 h，细胞接种于不含血清的RPMI-1640培养基，再加入相应浓度的高良姜素和阿帕替尼。将细胞铺于上室（1×104个细胞），使之终体积为200µL，下室中加入600µL RPMI-1640培养基。37℃培养24 h，下室弃去培养液，PBS冲洗2遍，加入4%多聚甲醛，室温静置30 min固定，再加入0.5%结晶紫静置10 min，蒸馏水冲洗，棉签轻轻拭去表面细胞。随机选择5个视野拍照，并对细胞计数。

1.7Western blot检测细胞凋亡及PI3K/Akt及p38-MAPK信号通路相关蛋白表达 取对数生长期细胞，接种于6 cm2的培养瓶，待细胞60%～70%融合时弃去培养基，加入含有相应浓度高良姜素和阿帕替尼的培养液，置于5%CO2、37℃培养箱孵育36 h。加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒定量。再加入适量的蛋白缓冲液，沸水高温变性，取40µg蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），转膜，加入胎牛血清封闭30 min，加入一抗，4℃孵育12 h，包括Ak（t1∶1 000）、p-Ak（t1∶500）、p38（1∶200）、p-p38（1∶500）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶200）、GAPDH（1∶1 000）；然后TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，孵育1.5 h，化学发光仪曝光显影，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.8统计学方法 使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据处理。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（组间多重比较采用LSD-t法）或两因素析因设计资料方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞增殖的影响 MTT结果显示，加药48 h后，阿帕替尼和高良姜素呈浓度依赖性地抑制胃癌SGC-7901细胞活性；与空白对照组相比，20 mg/L阿帕替尼和400 mg/L高良姜素对胃癌SGC-7901细胞呈现明显抑制作用（P＜0.05），见图1A、B。为进一步探讨高良姜素对阿帕替尼的增效作用，选择20 mg/L阿帕替尼联合100、200、300、400、500、600 mg/L的高良姜素作用48 h。结果显示，20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用明显高于单独应用20 mg/L阿帕替尼（P＜0.05），见图1C。因此，本研究选择20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素进行后续实验。

Fig.1 The inhibitory effect of apatinib combined with galangin ongastric cancer SGC-7901 cells图1 阿帕替尼联合高良姜素对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用

2.2阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞迁移的影响 单独使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明显抑制SGC-7901细胞迁移（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素对SGC-7901细胞迁移的抑制作用更加明显（P＜0.05），见图2、表1。

Fig.2 The inhibitory effect of apatinib combined with galangin on gastric cancer SGC-7901 cells图2 阿帕替尼联合高良姜素对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用

Tab.1 The effect of apatinib combined with galangin on migration,invasion and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells表1 阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞迁移、侵袭和凋亡的影响 （n=3，±s）

Tab.1 The effect of apatinib combined with galangin on migration,invasion and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells表1 阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞迁移、侵袭和凋亡的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：F1为单独20 mg/L阿帕替尼主效应的F值，F2为单独300 mg/L高良姜素主效应的F值，F3为20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素主效应的F值

组别空白对照组20 mg/L阿帕替尼组300 mg/L高良姜素组阿帕替尼+高良姜素组F1F2F3细胞迁移率（%）1.07±0.04 1.29±0.17 1.36±0.13 1.96±0.05 42.450＊＊59.067＊＊9.030＊穿膜细胞数（个/视野）55.33±1.53 78.67±4.04 107.33±2.52 149.33±4.51 282.471＊＊995.765＊＊23.059＊＊细胞凋亡率（%）6.09±0.04 17.90±2.64 9.43±0.06 22.73±0.35 9 545.859＊＊1 011.661＊＊33.771＊＊

2.3阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞侵袭的影响 单独使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明显抑制SGC-7901细胞侵袭（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素对SGC-7901细胞迁移的侵袭作用更加明显（P＜0.01），见图3，表1。

Fig.3 The effect of apatinib combined with galangin on the invasion of gastric cancer SGC-7901 cells图3 阿帕替尼联合高良姜素对胃癌SGC-7901细胞的迁移作用

2.4阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞凋亡的影响 单独使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明显诱导SGC-7901细胞凋亡（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼联合300 mg/L高良姜素对SGC-7901细胞凋亡的诱导作用更加明显（P＜0.01），见图4、表1。

Fig.4 The effect of apatinib combined with galangin on the apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells图4 阿帕替尼联合高良姜素对胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用

2.5阿帕替尼联合GLA对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与空白对照组比较，20 mg/L阿帕替尼组和300 mg/L高良姜素组Bcl-2蛋白表达明显下调，Bax蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与单用阿帕替尼比较，高良姜素联合阿帕替尼组Bcl-2蛋白下调更明显，Bax蛋白表达上调更明显（P＜0.05），见图5A。与空白对照组比较，20 mg/L阿帕替尼组和300 mg/L高良姜素组p-Akt蛋白表达明显下调，p-p38蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与单用阿帕替尼比较，高良姜素联合阿帕替尼组p-Akt蛋白下调更明显，p-p38蛋白表达上调更明显（P＜0.05），见图5B。

3 讨论

3.1GLA研究现状 阿帕替尼属于VEGFR2特异性抑制剂，是全世界第一个被证实对晚期胃癌有效的小分子靶向药物。阿帕替尼对晚期胃癌及转移性胃癌的疗效已获得充分肯定，但是随着其广泛使用，多数患者会发生耐药［8］，给晚期胃癌患者的治疗带来极大挑战。阿帕替尼上市时间较晚（2014年SFDA批准上市），对于其耐药性的发生机制尚缺乏相关报道。GLA属于黄酮类化合物，在姜科植物高良姜根部含量丰富。GLA具有多种药理作用，特别在恶性肿瘤方面表现出明显的活性。Xu等［9］证实GLA能诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡，其作用机制可能与降低线粒体膜电位有关。GLA不仅自身具有抑制肿瘤细胞的作用，还能增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，提示其是一种潜在的化疗增敏剂。但其能否提高胃癌细胞对阿帕替尼的敏感性尚鲜见报道。

3.2阿帕替尼联合GLA对胃癌SGC-7901细胞的迁移、侵袭作用 本研究发现，单独使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均可以明显抑制胃癌细胞的增殖，与Wu等［10］报道一致，说明高良姜素单药也具有抗胃癌的药理活性。进一步研究发现，经过活性筛选的300 mg/L高良姜素联合20 mg/L阿帕替尼对胃癌细胞增殖的抑制作用明显优于20 mg/L阿帕替尼单药处理，提示高良姜素增强了阿帕替尼对胃癌细胞的增殖抑制作用。Yu等［11］研究显示GLA联合顺铂可以呈剂量依赖性地抑制人肺癌细胞增殖，同时GLA单药可以抑制肺癌顺铂耐药细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达，并诱导细胞凋亡。本研究也证实，GLA联合阿帕替尼可以明显增强对胃癌细胞的凋亡诱导作用，提示其可以增强胃癌细胞对阿帕替尼的敏感性。迁移和侵袭是恶性肿瘤细胞发生远处转移的主要原因，转移性胃癌患者预后极差，且治疗选择有限。一项随机、双盲、安慰剂对照的Ⅱ期临床试验结果显示，阿帕替尼可以明显改善转移性胃癌的总生存期，研究者认为这可能与阿帕替尼抑制胃癌细胞迁移和侵袭表型有关［12］。本研究显示，GLA联合阿帕替尼对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用明显优于单用阿帕替尼，说明GLA增强了阿帕替尼对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制。Tolomeo等［13］也证实GLA可以增强伊马替尼对慢性髓样白血病细胞KCL22的毒性作用，并部分逆转KCL22细胞对伊马替尼的耐药性。

Fig.5 The effect of apatinib combine with galangin on expression levels of apoptosis and PI3K/Akt,MAPK related proteins of in gastric cancer SGC-7901 cells图5 阿帕替尼联合高良姜素对胃癌SGC-7901细胞凋亡及PI3K/Akt、MAPK通路相关蛋白表达的影响

3.3阿帕替尼联合GLA对胃癌SGC-7901细胞的凋亡及作用机制 PI3K/Akt通路是调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药的主要途径，其中Akt是PI3K/Akt通路的关键调控因子。Akt磷酸化后会激活一氧化氮合酶（NOS），并通过调控血管内皮生长因子（VEGF）介导肿瘤局部微血管形成。研究证实，包括胃癌在内的多数恶性肿瘤的发生、进展和耐药均与PI3K/Akt通路异常活化有关［14］。本研究发现，GLA联合阿帕替尼可以明显下调p-Akt蛋白表达，提示其增强胃癌细胞对阿帕替尼敏感性可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是近年来发现的与肿瘤细胞凋亡有关的信号转导通路，包括JNK、ERK、p38等关键调控因子；其中p38受细胞因子、药物、辐射等刺激而产生相应作用，参与肿瘤细胞的发生和进展。Zheng等［15］研究显示p38表达异常与肿瘤患者生存期显著相关。活化的p38可以抑制Bcl-2活化和诱导Bax转位，并通过诱导线粒体凋亡途径促进肿瘤细胞凋亡。本研究发现，GLA联合阿帕替尼可明显上调pp38表达，并抑制Bcl-2蛋白表达和诱导Bax表达，提示其可能通过激活p38 MAPK通路增强阿帕替尼对胃癌细胞的凋亡诱导作用。

3.4总结 GLA联合阿帕替尼可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。本研究同时发现GLA可能通过抑制PI3K/Akt通路和激活p38 MAPK通路增强阿帕替尼对胃癌的抑制作用。今后我们将建立裸鼠荷瘤模型，进一步在体内验证GLA联合阿帕替尼的抗胃癌作用。