周红利，林 森，李淑蓉，孙 静，苏炳银△

1.成都医学院 (成都 610500)；2.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室 (成都 610500)

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类天然免疫受体，介导神经退行性疾病的炎性反应[1]。在中枢神经系统中，TLRs主要表达于具有免疫功能的胶质细胞中，如小胶质细胞。TLRs种类较多，不同配体介导信号通路具有不同生物学效应，其信号传导通路根据其是否依赖髓样分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)，可分为MyD88依赖型和MyD88非依赖型两种途径[2-3]。MyD88是大多数TLRs信号转导中的接头分子，TLR3和TLR4是非MyD88依赖的β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing INF-β, TRIF)信号途经，介导释放细胞因子、趋化因子和转录因子，参与神经免疫炎症反应[4-5]。研究[6]证明，TRIF突变鼠表现为TLR3/4炎症反应缺陷。而TRIF过表达则可引起293细胞NF-κB和IFN-β启动子激活。研究[7-8]发现，中脑黑质部位多巴胺(dopamine,DA)神经元对微管解聚剂敏感，微管系统在DA 神经元存活中有重要作用。本课题利用微管解聚剂秋水仙素(colchicine,COL)构建轴突退变模型，使用TRIF敲除小鼠研究TRIF基因在黑质神经元退变过程中的作用，初步探讨在神经元退变过程中，TRIF对DA神经元及其轴突的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取TRIF基因敲除小鼠(TRIF小鼠)为实验组，由第三军医大学新桥医院杨清武教授赠予。具有相同遗传背景的C57BL/6小鼠(WT小鼠)为对照组。每组5只，雄性， 8～12 周龄，体重22～24 g。两组小鼠均使用COL药物构建小鼠纹状体-黑质轴突退变模型，小鼠生活于正常的 12 h光暗环境中，并能够得到充分食物和水。

1.2 主要实验试剂及设备

COL(Sigma，美国)；DA、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)及 二羟苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)标准品(Sigma，美国)；高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪(Alliance-2695，美国)；匀浆机(北京市科学器材公司)；台式高速冷冻离心机(Eppendorf 5810R，德国)；脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；旷场实验系统(上海软隆技发展有限公司);转棒仪(四川成都泰盟科技有限公司)。

1.3 构建轴突退变模型

采用立体定位微量注射，使用脑立体定位仪，在纹状体部位注射1 μL体积的COL(浓度1 g/L)制备模型。具体方法如下：用4%水合氯醛麻醉小鼠，剔除头部皮肤，将小鼠门牙固定在门齿固定器上，并用耳棒将头部两侧耳蜗固定好；皮肤消毒后，用手术刀切开颅盖皮肤，用3%双氧水轻轻磨损皮下组织，暴露前囟；以前囟为标点，向前0.8 mm，左侧旁开2 mm，进针深度为3.5 mm，缓慢注射；注射完毕后，留针5 min，最后消毒缝合皮肤。建模后随时观察，选择无感染小鼠进行后续实验。

1.4 行为学检测

1.4.1 一般行为学变化 在构建小鼠纹状体-黑质轴突退变模型过程中，注意观察各组小鼠是否出现震颤、肌肉僵直、转圈、运动迟缓等行为学方面的变化。

1.4.2 监测体重变化 在制备模型1、3、7、14 d后，用体重秤对两组小鼠体重进行检测，观察同时间点两组小鼠术后体重变化。

1.4.3 旷场实验 旷场实验是一项经典的评价啮齿类实验动物运动功能的行为学检测方法,已被广泛运用于神经行为学的基础研究[9-10]。本实验拿取小鼠放进旷场反应箱时，温柔轻放，记录小鼠活动时间5 min， 主要观察小鼠的自发活动行为。每次检测完，用酒精消毒擦洗干净。

1.4.4 转棒耐力检测 转棒实验设定转速为30 r/min，记录好小鼠能转棒的时间。每次检测5 min，在同1个时间点每只小鼠连续测3次，最后取平均值。

1.4.5 游泳状态检测 提起小鼠尾部，轻柔地放进游泳池，保持水温(25±2)°C，观察小鼠在1 min内游泳的方向及速度。待小鼠全部检测完及时更换笼子垫料。

1.5 HPLC检测

建模1、3、7、14 d 后，每组各取2只小鼠，直接将其断头处死。迅速取出全脑组织置于冰台上，快速分离纹状体，滤纸吸干后精确称重。将待测标本放入已加3倍量蛋白沉淀剂的离心管内，在冰浴上用搅拌器将组织块研成匀浆。静置30 min后，在4 ℃，离心速度12 000 r/min，离心半径10 cm条件下，离心10 min，取上清获纹状体匀浆后样本。蛋白沉淀剂制备、对照品储备条件及色谱条件均参照文献[ 11 ]进行，测定该模型4个时间点纹状体损伤侧中神经递质DA、DOPAC和5-HT等含量变化。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组小鼠建模后基本情况

在纹状体部位给予COL后，两组小鼠均表现为震颤、行动缓慢、打转、弓背等行为，提示轴突退变模型制备成功。实验组小鼠的静止性震颤、步态不稳较对照组更为明显。建模3 d后两组小鼠均有明显偏向运动(向损伤侧运动)(图1)。

图1 给药3 d后两组小鼠偏向运动状态

2.2 不同时间点两组小鼠体重的比较

组别与不同时间点的交互作用差异无统计学意义(F=0.170，P=0.916)。两组小鼠组间体重比较，差异有统计学意义(F=43.942，P<0.001)，两组小鼠组间体重比较不同时间点差异有统计学意义(F=63.426，P<0.001)(表1、图2)。

表1 不同时间点两组小鼠体重比较

图2 两组小鼠体重随时间变化误差折线图

2.3 不同时间点两组小鼠1 min内游泳里程比较

组别与不同时间点的交互作用差异有统计学意义(F=3.200，P=0.041)。两组小鼠组间1 min内游泳里程组间比较，差异有统计学意义(F=9.973，P=0.013)；两组小鼠组间1 min内游泳里程比较不同时间点差异有统计学意义(F=5.596，P=0.005)(表2、图3)。

图3 两组小鼠1 min内游泳里程随时间变化误差折线图

表2 不同时间点两组小鼠1 min内游泳里程比较

2.4 不同时间点两组小鼠5 min内旷场活动里程比较

组别与不同时间点的交互作用无统计学意义(F=0.304，P=0.822)。两组小鼠5 min内旷场活动里程组间比较，差异无统计学意义(F=4.533，P=0.066)，两组小鼠组间5 min内旷场活动里程比较不同时间点有差异(F=21.790，P<0.001)(表3、图4)。

图4 两组小鼠5 min内旷场活动里程随时间变化误差折线图

表3 不同时间点两组小鼠5 min内旷场活动里程比较

2.5 不同时间点两组小鼠转棒时间比较

组别与不同时间点的交互作用无统计学意义(F=0.496，P=0.689)。两组小鼠转棒时间组间比较，差异无统计学意义(F=1.828，P=0.213)，不同时间点两组小鼠组间转棒时间比较，差异有统计学意义(F=6.252，P=0.003)(表4、图5)。

表4 不同时间点两组小鼠转棒时间比较

图5 两组小鼠转棒时间随时间变化误差折线图

2.6 不同时间点两组小鼠纹状体中神经递质含量比较

HPLC检测结果证实，轴突退变模型建立1、3、7 d后实验组小鼠的纹状体神经递质DA及DOPAC含量低于对照组小鼠(P<0.05)，提示DA神经元退行病变加重。而建模后14 d后两组的纹状体神经递质含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图6)。

图6 HPLC检测两组小鼠制备模型1、3、7、14 d后纹状体神经递质含量变化

注：与实验组比较，*P<0.05

3 讨论

天然免疫受体不仅参与抵御外来病原体的免疫反应，而且参与神经免疫活动。TLR是一类天然免疫受体，中枢神经系统中，TLRs主要表达于小胶质细胞和巨噬细胞。大部分TLR通过MyD88依赖途经转导信号，主要引发小胶质细胞过度激活，产生炎症效应失控。TLR3和TLR4下游还存在另一种非MyD88依赖的TRIF信号途经，最终激活NF-κB 和IRF3，介导释放细胞因子、趋化因子和转录因子[12]。杨明[13]在研究中发现，TLR3/TRIF信号通路的激活可以促进小鼠帕金森模型脑内小胶质细胞活化，并且该信号通路的激活有利于脑内的炎症微环境向抗炎趋势转变。Packard 等[14]研究证实，通过TLR3的特异性配体PolyI∶C适度预刺激机体，能够一定程度上保护脑缺血引起的脑损伤。还有研究[15]证实，TLR2/6协同作用和TLR9激活作用能够保护感染了H3N2、H1N1的小鼠，使其免受致命性流感威胁。这些研究表明，TLR信号系统对中枢神经系统具有保护作用，TLR诱导小胶质细胞适度活化，可分泌多种神经营养因子，还可释放一些信号分子调控和减轻过度炎症反应。

微管系统是DA神经元存活的必备要素。已有研究[7-8]证实，纹状体内注射COL可以诱发黑质部位 DA 神经元变性以及黑质-纹状体通路逆行变性，观察DA轴突末梢微管系统对DA神经元存活的影响，并证明了 COL 能直接活化小胶质细胞和星形胶质细胞。本研究也采用COL 构建了小鼠纹状体-黑质轴突退变模型，两组小鼠均出现震颤、同侧转动、运动缓慢等症状，并且在给药后3 d 症状严重，小鼠体重较轻，在术的14 d小鼠体重逐渐升高，运动能力逐渐在恢复，说明小鼠DA神经元变性轴突退变后小鼠机体启动代偿功能，这与梁亚杰[8]制备的模型一致。同时，本实验进一步观察了TRIF在COL构建的小鼠纹状体-黑质轴突退变模型中炎症反应的作用。两组小鼠组间游泳路程及体重比较，差异有统计学意义(P<0.05)。HPLC检测结果显示，实验组小鼠脑部纹状体DA和DOPAC在1、3、7 d明显高于同时间段对照组(P<0.05)，该结果初步提示TRIF在纹状体-黑质轴突退变模型前期与MyD88引发的炎症损伤和神经毒作用形成拮抗作用。

综上所述，TRIF敲除小鼠轴突退变模型中DA神经元分泌DA及DOPAC明显低于WT小鼠，提示敲除TRIF基因能够加重轴突退变引发的DA神经元损伤，该损伤引发动物肢体运动功能受损，初步表明TRIF在正常机体中可能对神经元的递质水平有维持功能，并在轴突退变过程中具有保护功能，为认识天然免疫受体调控机制增加新内容。但本实验由于TRIF小鼠繁殖受限，每组小鼠的行为学检测分析统计样本较少，后期将扩大样本进一步做形态学及分子学水平多方面实验加以验证这一结论。