于 红，彭 珍，黄 涛，李君怡，熊 涛*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，食品学院，江西 南昌 330031）

枸杞，茄科类植物，又名苟起子、甜菜子、枸蹄子等，是一种药食同源的食物[1]。枸杞中含有多种生理活性成分，如枸杞多糖，具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抗辐射损伤、调节血脂、降血压、降血糖等功效，此外，枸杞中的胡萝卜素还可以美容养颜、滋润肌肤，适量食用有助于健康[2-3]。目前，中国市场上80%的枸杞仍以干果销售，深加工高附加值的产品较少，随着大健康产业的兴起，枸杞作为药食同源食物开发前景广阔[4]。研究表明，乳酸菌生长代谢会产生乳酸、胞外多糖、抗菌肽等物质，这些不仅有利于改善食品风味，还能提高营养价值，延长保质期[5-6]。因此利用植物乳杆菌发酵枸杞，增加了枸杞的营养价值，口感更加独特醇厚、营养成分更易吸收。枸杞中的乳酸菌又可以调节肠道菌群、降固醇等。

工业常用的干燥方式有常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等[7]。常压干燥的特点包括：设备简单，干燥时间长，不耐热成分破坏，产品易结块；减压干燥的特点是：温度低，产品质松易粉碎；喷雾干燥的特点有：温度高，热敏成分被破坏，产品损失较严重；真空冷冻干燥的特点是：低温环境有助于保护其风味和营养成分[8]，低压环境可以防止被氧化，保持菌活力，冻干前后物料的形状不会改变，内部呈现出均匀多孔的结构，并且会脱去90%～95%的水分，冻干粉的复水能力强且快，保质期也会延长[9-10]。冻干产品保持了食品特有的色香味，具有良好的贮藏保鲜和复水性，受到消费者欢迎。近几年冻干食品产量以30%的速度增加，主要用于供给航空航天、远洋、军事等特殊环境人群，以及快餐和方便食品行业。

目前，番木瓜片[11]、苹果片[12]、草莓片[13]、冬枣片[14]等果蔬食品的真空冷冻干燥已有研究报道，但对于枸杞粉的研究鲜有报道，更是缺少含有活菌的发酵枸杞粉的研究报道。现有研究大都采用共晶点作为物料的物性参数参考，但是针对一些多元复杂的溶液，有一部分的无定形态会形成玻璃体，此时共晶点并不能很好地提供依据和指导。冷冻干燥过程费时长、耗能多，需要准确测定物料的物性参数，制定准确可靠的控制程序，生产出高质量、节能、低成本的产品。本实验以植物乳杆菌发酵枸杞浆为研究对象，通过对冻干保护剂进行优化，从而提高益生菌存活率。同时还对其冻干机制进行研究，为研制高效果蔬冻干菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞购于宁夏银川；植物乳杆菌NCU137由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室保藏。

脱脂乳 双城雀巢有限公司；明胶 北京鑫达食品添加剂有限公司；麦芽糊精 国药集团化学试剂有限公司；海藻糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖 安徽省来发食品贸易有限公司；异乳糖、菊粉、低聚异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖 河南圣斯德实业有限公司；所有材料与试剂均为食品级。

1.2 仪器与设备

ZSD-A1160A全自动新型生化培养箱 上海精宏试验设备有限公司；YXQ-LS50S IIA/B3生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-50S II立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；万分之一精密电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SJ201A-250型榨汁机 浙江苏泊尔股份有限公司；冻干显微镜 德国bt1有限公司；功率补偿型差示扫描量热仪 梅特勒-托利多国际股份有限公司；超低温冰箱 海尔集团有限公司；真空冷冻干燥机 上海东富龙科技有限公司；西林瓶 沧州荣昌玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冻干工艺流程

筛选优良的干枸杞→干枸杞复水→打浆→灭菌→冷却→接种→发酵→加入保护剂→预冻→冻干

1.3.2 发酵枸杞浆的制备

选取质量、形态好的干枸杞，以1∶3的比例进行复水，打浆，102 ℃灭菌20 min，冷却后菌剂接种量为万分之一，培养发酵16 h，发酵完的枸杞浆在2 h之内备用。

1.3.3 共晶点、共融点与玻璃态转化温度的测定

使用差示扫描量热仪测定物料的共晶点、共融点以及玻璃态转化温度[15]；用电子天平称取10 mg左右调配好的枸杞浆放置于差示扫描量热仪的铝盘中，压盖放入仪器中进行测定。仪器的程序设定：一阶段以-10 ℃/min的速率从25 ℃到-50 ℃，保持2 min；二阶段退火过程，以10 ℃/min的速率从-50 ℃到退火温度-5 ℃，保持2 min；三阶段再以-5 ℃/min从-5.0 ℃到-50 ℃，保持2 min；四阶段以5 ℃/min的速率从-50 ℃进行连续扫描直至达到25 ℃。

1.3.4 崩解温度的测定

取2 μL冻干前发酵枸杞浆放置在冻干显微镜的载物台，以20 ℃/min的速率使物料的温度降到-60 ℃，维持150 s，待物料完全冻实后抽真空，真空度保持在10 Pa左右，以2 ℃/min的速率升至20 ℃，显微镜每5 s拍摄物料的照片，用于监控并记录冻干过程，确定物料的崩解温度[16]。

1.3.5 冻干曲线的绘制

在冻干过程中每隔10 min记录样品温度，通过记录的样品温度绘制冻干曲线，每个样品重复实验3 次。

1.3.6 冻干样品的制备

配制不同浓度的保护剂，102 ℃灭菌20 min，冷却至室温，将发酵枸杞浆重悬于不同的保护剂中，混合均匀，-80 ℃保存备用[17]。

1.3.7 保护剂的选择与优化

分别选取5%、10%、15%的脱脂乳、低聚异麦芽糖、菊粉、乳糖、海藻糖、异乳糖，10%、15%、20%的麦芽糊精，0.5%、1.0%、1.5%的明胶，1%、2%、3%的蔗糖，5%、10%、15%的麦芽糖醇，10 种不同梯度的保护剂[18-19]，分别加入到发酵枸杞浆中进行单因素试验，确定适宜保护剂及用量。以存活率为指标，通过正交试验进行复配，确定最佳冷冻干燥的复配保护剂。

采用MRS平板计数法，分别对冻干前和冻干后物料样品进行计数，依次配制1∶10的样品匀液，递增稀释，选择2 个适宜的稀释度进行平板计数。放入培养箱中培养48 h后进行计数。存活率的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 发酵枸杞浆物性参数的测定

2.1.1 共晶点、共融点、玻璃态转化温度的确定

图1 发酵枸杞浆的差示扫描量热温度曲线Fig. 1 DSC curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus

由于发酵枸杞浆属于多元溶液，成分较为复杂，多种溶质之间相互作用，结晶情况复杂，降温处理，水分的部分冻结成晶体的冰，其他成分结晶部分形成玻璃体[20-21]。由图1可以看出，当温度逐渐从25 ℃降到-50 ℃的过程中，4～6 min之间，即-22.70～-27.34 ℃之间有一个放热峰，这是因为发酵枸杞浆在由液态变为固态的过程中需要放出大量的相变潜热，峰为结晶峰，即确定发酵枸杞浆部分溶质的结晶点为-19.59 ℃。同理，当温度从-50 ℃升到25 ℃时，在34 min与38 min之间有一个比较矮的吸收峰，因为发酵枸杞浆在从固态到液态的过程中会吸收相变的潜热，起始点即共熔点为-5.28 ℃。因为发酵枸杞浆是复杂的混合物，并不能完全结晶，结晶点不能准确地反映样品的冻结状态，对于含有的非晶态高分子成分没有结晶点，玻璃态转化温度是非晶态物质的一个重要物理性质，当处于玻璃态时，分子链和链段都不能运动，达到稳固的状态。实验结果显示，经过10 ℃/min的速率从-50 ℃到-5 ℃的退火过程，在升温速率为5 ℃/min时发酵枸杞浆的玻璃态转化温度为-31.82 ℃，所以预冻终点温度低于-31.82 ℃。

预冻温度过低会增加冷冻能耗；温度过高，物料未能完全冻结，真空条件下水分快速蒸发，液体浓缩使冻干产品体积缩小，并且气体迅速冒出使产品鼓泡，影响产品的结构和质量。所以依据该物料的共晶点和玻璃态转化温度，在本实验中选择-40 ℃作为预冻温度。

2.1.2 崩解温度的确定

图2 冻干过程中发酵枸杞浆随温度改变的状态变化Fig. 2 Change in the state of fermented goji berry pulp with Lactobacillus during freeze-drying process

冻干过程分为两个不同的阶段，第1阶段称为升华干燥阶段，此阶段对于冻干粉的品质有很大的影响。升华干燥的温度是重要的控制指标，当温度超过物料的崩解温度时，物料结构就会遭到严重破坏，内部蜂窝状结构会产生塌陷，导致升华的水蒸气的通道被堵塞，从而影响物料的升华，使物料的质量和品质变差，所以崩解温度的确定具有重要意义[22]。由图2a可看出，常温时，呈现出的是冻结前样品为均匀分散的液态状态，相当于冻干预冻前的状态；图2b中，随着温度的逐渐下降，当下降到-17 ℃时，样品大部分物质冻结，即图片中逐渐由浅变深色的部分为冻结的样品状态；图2c温度继续下降，原来深色的部分颜色更加明显，此时样品已完全冻结，真空条件下冻结部分的升华界面开始逐渐形成，由于崩解坍塌的现象在冻干界面形成，生成升华界面可以更加清楚地显示样品崩解的状态，确定崩解温度。图2d显示，当温度开始上升，随着温度的逐步升高干燥层越来越宽，此时温度约为-38 ℃；图2e中，当温度上升到-35 ℃时，冻干界面开始出现小的白斑，即样品出现坍塌崩解的状态，白斑逐渐增大，直到完全崩塌如图2f。因此出现小白斑的温度确定为物料的崩解温度约为-36 ℃，所以升华干燥阶段温度低于-36 ℃。

升华干燥阶段，物料热量被升华热带走，需要加热板温度供给升华热。当加热板的温度较低时，热通量小，物料升华界面温度低，传质推动力小，干燥时间较长，同时干燥效率降低，当加热板温度升高时与之相反，但是加热板的温度不超过物料的共熔点和崩解温度，物料才能实现升华干燥。所以依据该物料的共融点和崩解温度，在本实验中选择-45 ℃作为升华阶段加热板的温度。

2.1.5 药品剂型的影响:同一药品的剂型不同,其在体内的吸收也不会相同,即生物利用度相异,如果不能掌握剂量就会导致不良反应的出现。

2.1.3 预冻时间的确定

图3 制冷温度-40 ℃条件下的发酵枸杞浆冻结曲线Fig. 3 Freezing curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus at -40 ℃

将物料放入冻干仓内，平衡至预冻的温度，此时的物料并没有完全的冻结，不可以直接进行升华干燥，此温度保持1～2 h样品才会冻实[23]。因此通过测定物料的冻结曲线确定预冻时间。当预冻温度为-40 ℃时的物料冻结曲线如图3所示，发酵枸杞物料进仓温度为27 ℃，20 min冷却到-5 ℃，平均速率为1.60 ℃/min。在20～30 min之间，温度下降缓慢，维持在-5 ℃左右，因为当物料从液态转变到固态时，会吸收较多的相变热，所以降温缓慢。当物料完成相变热阶段之后降温速度加快，在80 min时，温度下降至-23 ℃，平均速率为0.36 ℃/min。80 min后，温度下降速率变缓慢，由于物料温度与空气介质之间的温度差变小，所以温度下降速率随之变小，降速在115 min达到最低，并维持在-30 ℃。由此可知在约2 h物料可达到预冻温度，因此本研究确定发酵枸杞浆在-40 ℃预冻温度的冻结时间为4 h，此时的发酵枸杞已完全冻实。

2.1.4 发酵枸杞浆的冻干曲线绘制

图4 益生菌发酵枸杞浆真空冷冻干燥曲线Fig. 4 Freeze drying curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus

如图4所示，将一定量的发酵枸杞浆放入-40 ℃冻干仓中进行预冻4 h，冻实之后打开冻干机的冷阱，待冷阱温度降到-80 ℃时，打开真空，物料进入冻干过程的升华干燥阶段，此阶段加热板的温度为-45 ℃。由图4可知，该阶段物料从-43 ℃缓慢升温，20 h时，物料温度升至-20 ℃后趋于稳定，此时大部分自由水因升华被移除，待自由水除完，进入解析干燥阶段，此时除去的为结合水，之后缓慢升高加热板的温度，温度不可超过物料所能承受的最大温度。初步设置为-20 ℃，待物料稳定之后再升高至25 ℃，使物料温度逐渐缓慢升高，由图4可知，物料温度随着加热板温度的升高而逐渐增加，开始稳定在-10 ℃左右，待加热板温度升高到25 ℃时物料温度逐渐稳定在20 ℃左右，此时物料的结合水清除完，解析干燥结束。但是发酵枸杞浆的含糖量很高，冻干结束后很难形成冻干粉。

2.2 保护剂的优化

2.2.1 保护剂的选择

图5 不同保护剂对于发酵枸杞浆中的乳酸菌活菌数的影响Fig. 5 Effect of different lyoprotectants on bacterial survival in fermented goji berry pulp

保护剂的选择对于发酵枸杞冻干粉的品质有着至关重要的作用，加入有效的保护剂，可以减少恶劣环境对菌的伤害[24-25]，冻干枸杞粉复水时也能减弱对菌体的损伤，贮存期间也能很好地保持其稳定性[26-27]。对于其保护机理，目前主要有两种假说，一种是“玻璃态假说”，即许多大分子的保护剂在冷冻过程中会随着温度降低、电解质浓度增大形成一种非晶体的状态，这种状态称为玻璃态，由于这种状态为高黏态，它能起到较好的固定作用，能够防止生物大分子组织结构的变化，从而起到了保护的效果[28-29]，如大分子物质脱脂乳、麦芽糊精等通过玻璃态机制保护细胞组织结构。另一种是“水替代假说”，因为在冻干的过程中，水逐渐升华脱离物料，水的流失会使蛋白质的结构遭到破坏，一些保护剂会通过取代水的位置，通过氢键作用与蛋白质分子结合从而使蛋白质稳定不遭到破坏[30-31]。如海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖醇等一些糖类和醇类含有多个羟基，形成氢键能力较强，主要通过水取代作用保护细胞结构的稳定性。本研究通过选取10 种不同种类冻干保护剂进行实验，以活菌数作为最终的指标，确定最佳保护剂。由图5可知，保护效果较佳的依次为15%异乳糖＞20%麦芽糊精＞10%乳糖＞5%海藻糖＞5%脱脂乳，活菌数均达到8.76（lg（CFU/mL））以上。虽然当以异乳糖为保护剂时，产品活菌数较高，但冻干产品出现物料体积缩小、鼓泡的现象，冻干不易进行，可能是因为加入异乳糖后使物料的崩解温度降低，冻干时结构容易塌陷。故综合考虑，选择20%麦芽糊精、10%乳糖和5%海藻糖作为冻干保护剂。

2.2.2 复配正交试验结果

表1 正交试验设计与结果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

表2 方差分析结果Table 2 Results of analysis of variance

通常整个保护剂体系，应是由多种不同类型的保护剂组成的复配体。通过上述保护剂选择的实验结果综合考虑，选择3 种保护效果较佳的保护剂进行复配优化，分别为麦芽糊精18%、20%、22%，乳糖10%、12%、14%，海藻糖4%、5%、6%，选择L9（34）正交表，正交试验设计与结果见表1，方差分析见表2，由极差分析可知，影响发酵枸杞中细胞存活率的主次因素依次为乳糖、海藻糖、麦芽糊精，乳糖极差最大，分析方差达到了显著水平，对活菌的保护效果最佳，分析可知理论最佳优化组合为

A2B3C3。对最佳结果进行验证实验，重复3 次，结果表明组合A2B3C3的存活率达到了91%，与理论相符，即最佳的复配组合为20%麦芽糊精、14%乳糖、6%海藻糖。

2.3 样品冻干工艺的确定

图6 添加复配保护剂的发酵枸杞浆冻干样品扫描电镜图Fig. 6 Scanning electron microscope images of freeze-dried samples from fermented goji berry pulp with the lyoprotectant combination

图7 添加复配保护剂的发酵枸杞浆样品冻干曲线Fig. 7 Freeze drying curve of fermented goji berry pulp with the lyoprotectant combination

由图6可看出，当测定崩解温度时，温度上升到-21 ℃，小白斑开始形成，物料出现坍塌崩解，由此可以确定样品的崩解温度约为-21 ℃。所以当加入保护剂后，不仅保证了益生菌发酵枸杞冻干粉的高活性，还提高了样品的崩解温度，降低了能耗。本实验设定升华干燥阶段温度为-30 ℃并绘制冻干曲线（图7），实验结果显示，样品从-25 ℃逐渐升温，在13 h时升到-10 ℃并趋于稳定，与发酵枸杞浆的冻干相比，不仅升高了升华干燥温度，缩短了时间，还降低了较多的能耗，并且冻干结束后可得到色泽好、质量佳、高活性的益生菌冻干枸杞粉。

3 结 论

冻干食品不仅保证了食品的品质和营养，相比于一些罐装、冷冻食品，更容易运输且能长时间保鲜[32]。本研究以复水枸杞浆为原料，经植物乳杆菌发酵16 h后，测定了发酵枸杞浆的物性参数，并以菌体存活率为指标来进行保护剂的选择与优化，最终完成冻干曲线的绘制。结果表明，发酵枸杞浆的物性参数：结晶点为-19.59 ℃，共熔点为-5.28 ℃，玻璃转化温度为-31.82 ℃，崩解温度约为-36 ℃，根据物料的物性参数，确定了预冻温度为-40 ℃，绘制预冻曲线并确定预冻时间为4 h，升华干燥阶段的温度设置为-45 ℃，完成发酵枸杞浆的冻干曲线绘制；复配保护剂为20%麦芽糊精、14%乳糖、6%海藻糖的保护效果最佳；加入复配保护剂后，样品的崩解温度约为-21 ℃，确定升华干燥温度-30 ℃并绘制样品的冻干曲线，得到了富含活菌的枸杞粉。益生菌发酵枸杞粉冻干后活菌数高达9.6（lg（CFU/g）），含水量低于3%，色泽完好，复水性强，产品质量佳。冻干发酵枸杞粉既保持了特有的保健功能，又含有大量的活菌可以调节胃肠菌群生态平衡，迎合了消费者对高品质食品的需求，符合大健康产业发展趋势，因此市场前景非常的广阔，必将受到越来越多消费者的青睐。