孙 乾，张爱琴，薛雨菲，曹文利，奚凤玲，王荣浩，李 芳，孔令明,*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆轻工职业技术学院，新疆 乌鲁木齐 830021）

核桃（Juglans regia）在我国多省都有种植。到2016年，我国核桃种植面积超500万 hm2，年产量近300万 t，其占经济类树林总面积的15%左右，居世界之首[1]。核桃营养丰富，含蛋白15%～20%、含脂肪60%～70%、含人体所必须的多种VA、VE、VD、VK等较高[2]。核桃中的优质植物蛋白，是促进大脑活性和减缓衰老的健康蛋白[3-4]。目前，核桃的食用性，一般为榨油或直接食用。但对核桃榨油后副产物的综合性利用，以及占核桃蛋白总量70%以上的谷蛋白的研究还鲜有报道，对产业化生产脱脂、分离、浓缩核桃粉，都缺乏规模化、科研化、技术化、集约化的深加工。由相关的文献论述[5]，核桃蛋白大部分为谷蛋白，其不溶于水、油，因此，极大限制了核桃蛋白在食品领域中的应用。

蛋白质的化学性修饰主要是氨基酸的残基化修饰，其中分为酰基化、磷酸化、糖基化等反应，这些反应都是针对氨基酸残基上的—COOH、—OH、—NH2和—SH加以改性作用[6]。通过改性可改善原蛋白的一些功能特性，诸如溶解度、持水（持油）性、乳化特性、热稳定性、表面特性、凝胶性等。常使用的酰化剂有琥珀酸酐、马来酸酐等；常用的磷酸盐有复合磷酸盐、三聚磷酸钠、多聚磷酸钠等。

有研究者采用不同改性剂对蛋白进行改性，高度的酰基化使蛋白在偏碱性的环境下溶解度增加，POCl3改善了蛋白结构，提高了蛋白质功能特性[7]。磷酸化的改性，使蛋白空间结构得以改变，肽链的延展伸缩，溶解度有所提高，随着溶解度的提高，其乳化性等功能特性以及黏度都有相应的提高；刘雯等[8]以提取率为参照指标，发现大豆蛋白改性前后有4.37%和23.46%的提高；奚海燕[9]以磷酸化程度为指标，发现3%的三聚磷酸钠使大豆蛋白有最大改性。

荧光光谱是研究液态蛋白质分子构象的一种方法，其可以通过对氨基酸的荧光特性反映蛋白的疏水性，且灵敏度高、方法简单、所需样品量少；紫外分光光度法可研究蛋白二级和三级结构变化，以及测定蛋白的溶解度、乳化性等，其灵敏度高、选择性好、精密度高；傅里叶红外光谱可以对蛋白质二级结构在不同环境下定性和定量分析，其分辨率高、重复性好、测量简单、扫描较快；圆二色光谱又称圆二色曲线，远紫外区一般是肽键的吸收峰，反映蛋白质主链的构象，近紫外区一般是蛋白质的侧链基团，反映氨基酸及其残基的细微构象变化。

核桃供应量持续增长，开发率依然较低，初加工耗时费力，附加值始终不高。因此，为更加有利于核桃资源的开发，实验采用化学方法对核桃蛋白进行改性处理，以此使核桃饼粕中的优质蛋白得以更加全面的综合性利用，对核桃产业的精深加工意义深远。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃饼粕（榨油后制得） 新疆中亚食品有限公司；核桃谷蛋白（walnut glutenin，WG）由核桃饼粕制得；大豆油 新疆友好集团股份有限公司。

十二烷基硫酸钠、氯化亚锡（SnCl2·H2O） 北京索来宝科技有限公司；琥珀酸酐（丁二酸酐） 上海源叶生物科技有限公司；三聚磷酸钠、无水乙醚、石油醚（均为分析纯） 天津致远化学试剂有限公司；溴化钾（色谱纯） 山东嘉颖化工科技有限公司；2-乙氧基乙醇（分析纯） 北京津同乐泰化工产品有限公司。

1.2 仪器与设备

Testo205便携式数显pH计 德图仪表（深圳）有限公司；PL203电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；TDL-5-A低速离心机 上海安亭科学仪器厂；ALPHA 1-2型真空冷冻干燥机 德国Marin Christ公司；TU-1810PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SENS-9003型荧光光谱分析仪 北京卓立汉光仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；J-810圆二色光谱仪 日本Jasco公司；JEOL700F扫描电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 WG的制备

工艺流程：核桃饼粕→脱脂核桃粕→加去离子水→离心→沉淀→加NaCl→离心→沉淀→加体积分数70%的乙醇→离心→沉淀→加NaOH溶液调pH值→离心→上清液→加HCl溶液调pH值至等电点→离心→沉淀→水洗至中性→真空冷冻干燥→WG[10]。

1.3.2 改性蛋白的制备

工艺流程：WG→制备溶液→搅拌→调pH值→加酰化剂（加磷酸盐）→搅拌→调pH值→透析→真空冷冻干燥→改性蛋白。

将2.00 g WG分散在30 mL去离子水中，室温下搅拌1 h，用1 mol/L NaOH溶液调不同pH值，然后分批加入一定量的琥珀酸酐（磷酸盐），反应过程中不断搅拌，并用1 mol/L HCl或NaOH溶液维持溶液pH 7.0不再变化至终止反应（一般为5～60 min）。将酰化蛋白溶液在4 ℃透析48～72 h以渗透压形式过滤未反应的琥珀酸酐，浓缩溶液后进行真空冷冻干燥处理，即为酰化蛋白（acylated protein，AP）。磷酸化蛋白（phosphorylated protein，PP）实验组不用透析，对照组不添加任何试剂[11]。

1.3.3 溶解度的测定

根据Horax法稍作改动[12]。分别称取0.10 g WG、AP与PP样品分散于10 mL去离子水中，室温下磁力搅拌0.5 h左右，溶液以4 500 r/min离心15 min，留取上清液待用；取空试管，加入5 mL考马斯G-250，加入50 μL去离子水，再加入50 μL上清液，剧烈振荡1 min左右以混匀；放置10 min，在波长595 nm处测量，对照组加入5 mL考马斯G-250，再加入100 μL去离子水。蛋白质溶解度计算如式（1）所示：

1.3.4 荧光光谱分析

精确称取WG和改性蛋白样品溶解于pH 7.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液中，调蛋白质量浓度为0.3 mg/mL。在25 ℃条件下放置3 h，采用荧光光谱分析仪测定WG、AP与PP的样品荧光特性。取约5 mL样液置于四通石英比色皿中，选择荧光光谱的激发波长为310 nm，发射光谱的波长扫描范围为410～460 nm，选择狭缝为5 nm，每个样液重复扫描3 次。

1.3.5 紫外光谱分析

精确称取WG、AP与PP样品溶解于pH 7.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液中，调蛋白质量浓度为0.1 mg/mL。取约5 mL样液置于置于1 cm的石英比色皿，用分光光度计测定样品的吸光度，样品的扫描波长范围为200～400 nm[13]。

1.3.6 红外光谱分析

精确称取WG、AP与PP样品1 mg加入溴化钾进行缓慢研磨至均一的粉末状，在模具中以8 MPa压制2～3 min制成薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪在（4 000～400 cm-1）全波段上扫描，分辨率4 cm-1，波数精度0.01 cm-1，扫描次数32[14]。

1.3.7 蛋白质二级结构的圆二色光谱分析

精确称取WG、AP与PP样品溶解于pH 7.0的磷酸缓冲液中，调蛋白质量浓度为0.3 mg/mL。在25 ℃条件下放置3 h，采用圆二色光谱仪测定WG的圆二色性。取约5 mL样液置于2 mm石英比色皿中，选择扫描的波长为190～250 nm，扫描速率为100 nm/min，响应温度为25 ℃，灵敏度为100 mdeg/cm，分辨率为0.5 nm。所测出的图谱需扣除缓冲液的空白差，每个样液重复扫描8 次取平均值，蛋白的二级结构采用JASCO结构软件进行分析，圆二色性以残基摩尔椭圆率表示（℃·cm2/dmol）。

1.3.8 扫描电子显微镜观察

取WG、AP与PP的粉末样品进行喷金处理，将样品处理好之后加压至20 kV，用扫描电子显微镜观察[15]。

1.3.9 酰化度的测定

采用茚三酮法进行测定，配制质量分数1%的WG、AP与PP样液，取空试管，加入1 mL样液，再加入0.02 g/mL茚三酮溶液1 mL，盖塞摇匀；混合液于100 ℃水浴上加热10～15 min，取出后在20～25 ℃的水浴中冷却，加入5 mL去离子水，尽快在波长570 nm波长处测量。对照组以0.02 g/mL茚三酮溶液作空白。酰化度计算如式（2）所示：

1.3.10 持水性的测定

参考Paredeslopez等[16]的研究并作一定修改。准确称取0.10 g的WG、AP与PP粉末置于离心管中，加入10 mL去离子水，使用离心机4 500 r/min离心15 min。称取样品和离心管质量，持水性计算如式（3）所示：

式中：M0为样品质量/g；M1为离心管与样品总质量/g；M2为离心管与沉淀物质量/g。

1.3.11 持油性的测定

依照Pedroche等[17]的研究并作一定的调整，准确称取0.10 g的WG、AP与PP样品置于离心管中，加入大豆油5 mL，旋涡式振动60 s，然后3 300 r/min离心15 min，吸纸吸去残留油脂，持油性计算如式（4）所示：

式中：M0为样品质量/g；M1为离心管与样品总质量/g；M2为吸油后离心管与样品总质量/g。

1.3.12 乳化性及乳化稳定性的测定

取空试管，加入5 mL蛋白样液，加入25 mL去离子水，再加入20 mL大豆油，旋涡式振动60 s，然后2 500 r/min离心乳化5 min，分辨乳化层[18]。乳化性计算如式（5）所示：

精确称取5 g样品溶于100 mL去离子水中，调节至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速乳化均质1 min左右；放置于45 ℃水浴中45 min左右，测量乳化层的高度（H0），30 min后再次测量乳化层的高度（H1）[19]。乳化稳定性计算如式（6）所示：

1.3.13 起泡性及泡沫稳定性

精确称取WG、AP与PP样品溶解于pH 7.0的磷酸缓冲液中，取空试管，加入10.0 mL样液（V0），高速乳化均质2 min左右；迅速测量总体积（V1），30 min再次测量总体积（V2）[20]。起泡性与泡沫稳定性计算如式（7）和式（8）所示：

1.4 数据处理

每个实验做3 次重复。运用Excel 2003进行图形绘制，光谱图采用系统自带软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 酰化度的测定结果

酰化蛋白样品实验根据式（2）中对酰化程度加以计算得知，经琥珀酸酐（丁二酸酐）改性的AP其酰化度为（77.26±0.49）%。吸光度的百分数表示游离氨基与茚三酮溶液的反应程度，吸光度越高，反应程度越高，酰化度越低。因此经琥珀酸酐改性后的WG其被酰化的程度较高，说明酰化较充分。

2.2 荧光光谱分析

使用荧光分光光度计对WG、AP和PP进行扫描测定。在310 nm的激发波长处所产生的荧光光谱主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，谱图上显示的荧光峰实质为色氨酸基团由于光激发产生的电子跃迁所导致，峰的位置在428～431 nm波长范围内（图1），AP与PP的化学改性可能是由于改变了蛋白质中的氢键，使得部分氢键产生断裂，而蛋白分子内部的氢键是决定蛋白质分子中α-螺旋和β-折叠稳定性的重要因素，氢键的破裂会导致蛋白二级结构的不稳定。荧光强度的改变也说明了色氨酸在改性后出现大量的衰减，且改性蛋白的最大吸收峰强度也发生了轻微的红移。蛋白分子逐渐展开分子链，将更多的亲水性基团暴露出来，使得亲水性极大增强，从而使溶解度有极大的提高[21-22]。

图1 WG与改性蛋白的荧光光谱Fig. 1 Fluorescence spectra of natural and modified glutenin

2.3 紫外光谱分析

蛋白的紫外吸收最为关键在于蛋白质侧链上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基所引起，此3 种氨基酸在蛋白中的存在以及存在的数量性直接决定了蛋白的紫外吸收强度水平。在另一种意义上也与组氨酸和半胱氨酸基团有关，但相关性要弱于前3 个氨基酸。由图2可知，WG的最大紫外吸收波长为280 nm，这反映了WG的紫外吸收主要是由于其蛋白内的色氨酸和酪氨酸残基引起的[23]。由图2所示，当进行酰基化和磷酸化处理时，AP与PP的紫外吸收明显增强，且这种增强极显著（P＜0.05）；WG的最高紫外吸收峰出现在280 nm波长处的0.44，而AP与PP的最高紫外吸收峰分别出现在282 nm与283 nm波长处，且吸光度分别为1.69和1.44。经AP与PP处理的蛋白，其两者之间的差异并不显著（P＞0.05）。

随着化学改性的处理，所有改性蛋白的吸收峰均出现在275～279 nm之间，蛋白紫外吸收峰出现蓝移，说明色氨酸、酪氨酸等残基基团所处微环境的极性状态发生了改变，这种改变也相应会引起肽键的断裂，而肽链上的色氨酸、酪氨酸残基属于极性氨基酸，所带的杂环π→π*电子跃迁是引发紫外吸收的关键因素，蛋白质肽链的逐渐展开，π→π*和n→π*电子的跃迁能量逐渐增大，也导致了紫外吸收的相对增强[24]。

图2 WG与改性蛋白的紫外光谱Fig. 2 UV absorption spectra of natural and modified glutenin

2.4 红外光谱分析

蛋白质中的二级结构通常包括α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规卷曲。在酰胺I带上是蛋白不同二级结构信息的叠加，对谱图可以进行线性拟合以确定出结构与峰形之间的相对应关系。在1 700～1 600 cm-1的酰胺I带一般是蛋白质所在的特征峰，也常用于蛋白质二级结构的分析，这主要是由于蛋白质中含有C—O键伸缩振动所形成的，也正是因为这样，此处的信号较强[25-27]。蛋白质作为两亲性结构的代表，疏水性和亲水性是决定其乳化性的一个重要指标。

WG主要由其中的谷蛋白组成，这也使得WG持水能力较差，而相比持油性较为稳定，因受到化学改性的作用，改性蛋白在空间结构上受到较大破坏，大量的亲水性基团暴露，这也使得WG的亲水性有很大的提高。

由图3可以看出，经过化学改性处理的蛋白，其波形均向高波数蓝移了约0.5～1 cm-1。这说明蛋白在受到化学剂的影响下，其结构变得不稳定，原本的结构开始逐渐解离。当氢键作用较弱化时，C＝O的电子云密度逐渐升高，导致吸收峰位向高波数方向蓝移。由图3还可以发现，在改性后的蛋白中，α-螺旋结构的含量有一定的升高；相应的无规卷曲与β-转角结构，基本没有变化；β-折叠结构含量有一定的上升，这些都表明了核桃蛋白在受到化学改性后，其疏水性的基团逐渐减少，而亲水性的基团逐渐增多[28]。α-螺旋和β-折叠是有序的蛋白结构，具有一定的稳定性；而β-转角和无规卷曲则是无序的蛋白结构，其会较易发生改变。由于化学作用，会产生一定数量的—OH和—COOH，这在一定程度上使得β-折叠结构被破坏，并与α-螺旋和β-转角之间相互转化[29]。

图3 WG与改性蛋白的红外光谱Fig. 3 Infrared spectra of natural and modified glutenin

2.5 圆二色光谱分析

圆二色光谱常被用作定量分析植物性蛋白二级结构的组成，且可分为远紫外和近紫外两个区域，远紫外区是肽键所在的吸收范围，其能够较为直观地反映肽链结构。在远紫外光区，210 nm波长处的负峰显示具有α-螺旋结构，而α-螺旋结构过于稳定，在一定程度上会阻止蛋白的构象受到改变，蛋白质趋于稳定状态，不利于蛋白功能特性的改变[30]；相比α-螺旋结构，β-折叠与无规卷曲结构使得蛋白稳定性较差，从而促使蛋白的柔性以及功能特性有良好的改变。蛋白分子的柔性越好，相应表现出蛋白的乳化特性越好。

图4 WG与改性蛋白的圆二色光谱Fig. 4 Circular dichroism spectra of natural and modified glutenin

如图4所示，未改性的WG其二级结构主要为β-折叠，且α-螺旋结构占17.62%，平均是改性蛋白的1.27 倍（表1）。经化学改性的AP、PP与未经改性的WG相比，其α-螺旋结构呈现明显的下降，而β-折叠结构呈现上升趋势；β-转角结构在整体上变化不明显，无规卷曲结构在一定程度上有所变化。

表1 WG与改性蛋白二级结构变化的对比分析Table 1 Comparative analysis of secondary structures of natural and modified glutenin

2.6 扫描电子显微镜对WG与改性蛋白的观察

图5 核桃谷蛋白与改性蛋白的SEM图（×5 000）Fig. 5 SEM photographs of natural and modified glutenin (× 5 000)

由图5可以看出，未经任何改性处理的WG呈现出圆球状的小颗粒，并相互呈散落状，即使有较大块的颗粒也比较少见；AP与PP，已不见松散的圆形小颗粒，取而代之的是有空隙的、大片或是块状的结构。从前后2 种结构可以得出，经酰基化与磷酸化改性处理会使原本球聚的蛋白结构转向片状或块状的结构，这可能是因为WG由于改性而使得肽链展开所形成。而这种展开的表面积增大的结构会更有利于蛋白质溶解度、持水性的提升[31-34]。

2.7 功能指标分析

对改性前后WG加以功能指标的测定，并横向、纵向对指标进行对比。由表2可知，未改性WG溶解度为17.43%，而改性后AP与PP的溶解度分别为80.29%和95.60%，改性后的AP与PP溶解度分别提升了3.61 倍和4.49 倍；未改性的WG其持水性和持油性分别为4.27 g/g和4.81 g/g；而AP与PP的持水性和持油性分别为12.68、10.90和4.71、3.87，经过改性处理的WG其持水性显著高于未改性的，持水性提升了1.97 倍和1.55 倍；通过数据表明，谷蛋白的溶解度与持水性有较明显的相关性，且较高的溶解度对应较高的持水性。这与毛晓英[35]的结论稍有不同，可能是因为单一的谷蛋白与全蛋白或粗蛋白在蛋白结构以及氨基酸组成成分上有不同，因此结论会有一定的差异性。这其中还可能是因为蛋白质分子大小、形状、蛋白质构象的不同所导致蛋白质中氨基酸以及其侧链的带电性不同。经过改性处理的WG其持油性略低于未改性的，持油性降低至未改性的97.92%和80.47%，持油性略有降低；通过酰基化改性的AP其持油性基本上与WG保持一致，而PP的持油性有一定程度的下降，这可能是因为两种化学改性使得极性氨基酸数量有一定程度的增长，而非极性氨基酸处于减少的状态，且在制备改性蛋白的过程中，谷蛋白会有一定的微变性，导致亲水性氨基酸基团逐步暴露。El Nasri等[36]研究表明，一定的表面积和疏水性可以有助于增大相应的持油性，同时含量较高的蛋白质会相应有较高的持油性。有研究[35-37]指出，葵花籽与大豆蛋白含量的增加可以提高产品的品质，使得产品的持油性有所提高。改性前后WG的持油性均比毛晓英[35]报道的分离和浓缩蛋白高（2.81、2.50 g/g和2.43 g/g），蛋白质的持油性强弱决定了其在肉制品加工过程中，能否增强肉质的乳化程度，改善食用品质口感。通过数据分析，改性后的AP与PP具备高度的持水性和一定的持油能力，这可以为肉及肉制品的加工发挥更大的作用。

经磷酸化处理的PP与WG和酰基化改性AP的乳化性有显著的不同，PP的乳化性最高为34.38%，表现出了显著差异（P＜0.05）；而WG与AP的乳化性差异不显著（P＞0.05）；这一结果基本与葵花籽、腰果等蛋白的测定结果一致。而在乳化稳定性上，经化学改性处理的谷蛋白其稳定性明显减低，由未改性的64.58%降至38.46%，其差异显著（P＜0.05）。

在溶解度、疏水性以及黏性等因素中，对于起泡性的变化都有一定的影响，且较大的蛋白分子具有良好的泡沫稳定性。这可能是因为蛋白质分子的肽链受到外界环境的干扰，其分子柔性不断增强，蛋白质能够向气-水界面运动效率得到了一定的提升，因此使得起泡性有一定改善[37]。由表2可知，经过改性处理的谷蛋白起泡性并没有得到一定的改善，但PP的泡沫稳定性是WG的1.2 倍，这种改善效果也并不明显。

表2 改性前后谷蛋白的功能性质比较Table 2 Comparison of functional properties of natural and modified glutenin

3 结 论

经酰基化处理后的AP溶解度为80.29%；经磷酸化处理后的PP溶解度为95.60%。经琥珀酸酐改性蛋白的酰化程度为（77.26±0.49）%，说明酰化较充分。

荧光强度被影响发生较大变化，且吸收峰出现红移现象，说明蛋白的亲水性与疏水性发生了一定的变化，疏水性快速下降；紫外光谱的最大吸收波长为284 nm，且出现蓝移现象，表明了色氨酸以及酪氨酸残基极性状态有一定改变；红外光谱分析疏水性的基团逐渐减少，而亲水性的基团逐渐增多；圆二色光谱显示蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲结构都有不同程度的变化，表明了蛋白的高级结构发生变化，因而影响到蛋白的溶解度与持水能力有明显提高；在扫描电子显微镜下清晰发现，蛋白的微观结构以及分布特征发生明显变化，这也对蛋白的功能特性有相应的影响。