周俊宇

摘 要 随着畜禽养殖业的进步发展以及国家动物疫病检测计划的实施和地方动物疫病预防与控制工作的进行，基层兽医实验室的发展也逐渐完善，动物免疫抗體检测在动物疫病的防治上发挥出了巨大的作用，但是其在实验过程中也因各种因素而导致实验结果出现异常，继而影响动物疫病防治的效果。基于此，本文结合牛血清A型口蹄疫抗体检测实验就影响兽医实验室抗体检测结果的因素及对策进行了分析。

关键词 兽医实验室；抗体检测；影响因素；注意事项

1 引言

抗体检测工作的开展能够针对一些畜禽疾病进行有效的检测，以便提出更好的诊疗办法，但是实验室在实际操作中，往往会因为试剂因素、样品因素以及人为因素造成检测结果失真的现象，由此有必要深入分析其影响因素，并积极采取措施规范实验室操作，确保检测结果的精确有效，以便为基层兽医实验室的工作开展提供依据。

2 影响兽医实验室抗体检测结果的因素

2.1 试剂因素

实验过程中使用的如阳性血清、标准抗原、稀释液以及阴性血清等试剂都会直接影响到抗体检测质量，因此需要严格注意ELISA 检测相关试剂盒的购买情况，使用过程中还需要注意ELISA 检测试剂盒生产日期及保存环境温度，如果保存不当或者是过期都有可能会出现错误，影响抗体检测结果。

2.2 样品因素

待检样本的质量是确保实验结果准确性的重要因素，如果被检样品被污染就可能导致 ELISA 敏感性和准确性降低，因此在样品采集过程中应严格注意样品采集的方式、时间以及样品的前期处置和保管工作。在抗体检测过程中，还需要注意不能重复多次冻融样品，以免样品的蛋白质结构被破坏而出现错误的检测结果。

2.3 人为操作因素

2.3.1 加样操作因素

在检测过程中加样成为影响检测结果主要因素，尤其是人为加样过程中，必须要保证加样的均匀、定量，不能出现气泡。需要注意加样之前的样品确保是在完全解冻的状态下，加样后必须要完全混合均匀才能够进行检测工作，否则就会出现特异性反应。

2.3.2 温育时间与温度

ELISA 检测相关抗体时需要进行孵育来使被检样品和所包被抗原或者抗体更好的结合，因此需要参照说明书要求对不同类型抗体检测过程进行孵育，如果时间、温度控制不当还有可能造成被检样品不能与抗体或者抗原结合形成抗原符合物，使得实验结果严重失真。

2.3.3 洗板次数因素

ELISA 检测相关抗体需要自加完二抗进行孵育后进行洗板工作，但是洗涤次数过多容易洗掉反应结合的复合物，洗板次数过少导致洗涤不干净，容易造成二抗稀释液的残留，导致实验结果失真。

3 兽医实验室血清学抗体检测操作应用

使用牛口蹄疫A型抗体检测过程作为实例分析讲解基层兽医实验操作的注意事项， 以待提高实验室抗体检测结果的准确性。

3.1 实验用品的准备

首先，准备好实验中需要用到的仪器耗材，包括酶标仪（型号：MK3）、深圳某生物公司生产的合格期内的试剂盒、高压灭菌锅、离心机、纯水机、均质器等。其次，制备待检血清，要求血清清亮，无溶血，共10份样品。

3.2 实验器材的消毒

除了实验中需要用到的一次性用具可以直接使用以外，其他可重复使用的实验用具必须要用烘箱或者高压灭菌进行消毒才能够使用。

3.3 实验操作的过程

3.3.1 牛口蹄疫A型抗体检测试验基本步骤：

1.试验设置阳性对照1孔、阴性对照2孔；

2.加样：将阴性对照、阳性对照、待检样品血清按10μl/孔加入孔内，再按40μl/孔加入抗体工作液，加完后震荡混匀，

3.温育：盖上封板膜，置37℃温育60分钟；

4.洗板：揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作浓度洗涤液每孔加250μl，后甩去孔内液体，以上步骤重复5次，最后在干净吸水纸上拍干；

5.温育：每孔加酶结合物50μl，盖上封板膜，置37℃温育30分钟。

6.洗板：小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗涤5次，方法同4.切记最后在干净吸水纸上拍干。

7.加显色剂：每孔加显色液100μl，混匀，盖上封板膜30℃避光显色10分钟。

8.加终止液：每孔加终止液50μl，使反应终止，10分钟内测定结果。

3.3.2 实验操作注意事项

（1）加样位置

加样位置至关重要，因为实验中涉及阳性血清、阴性血清、被检血清三种，如果稍不留意容易混淆，一旦加样的位置错误，容易导致阴性对照及阳性对照的成立条件无法形成，从而导致实验失败。

（2）移液枪头的及时更换

移液枪头必须要保证每取一份血清就更换一次，如果交叉使用，容易造成样品污染，继而影响实验结果。

（3）孵育的条件及时间

孵育的时候应注意避光，而且温度要控制在37℃，因为酶的活性在37℃时活性最高，温度过高或者过低都会影响其活性，所以温度控制在37℃使酶结合物跟底物能充分反应。其次，温育时间也很重要，温育时间若人为延长，会导致非特异性结合紧附于反应孔周围，不能完全清洗干净，使试验结果不准确。所以，在实验过程中，应按照说明严格控制操作温度和时间。

（4）洗板

配制洗涤液时应使用新鲜无污染的蒸馏水或去离子水，现配现用。洗板时需保证微孔板平放，将洗涤液注满各孔，每次洗涤都要充分，尽量避免漏液、溢液现象。

（5）显色

显色是无色的底物生成有色产物的温育反应，反应的温度和时间仍是影响显色的因素。加入底物后应立即避光显色。显色剂尽量在临使用前配制，现配现用。若底物呈现颜色变化则坚决不能再用。

（四）结果判定

试验成立的条件：

阴性对照OD值>0.5，同时阳性对照（P）阻断率>50%

计算方法：

PI（阻断率）={1-（样品OD值÷阴性对照OD均值）}×100%

阴阳性判断：

PI（阻断率）>45%则判断为阳性；PI≤45%则判断为阴性。

4 结语

从实验结果看：1.阳性和阴性对照条件成立，实验有效；2.图表中阳性代表经过口蹄疫A型抗体免疫的牛血清中含有抗体，阴性则代表没有检出其含有口蹄疫A型抗体，免疫综合率占50%；3.样品的标准偏差都控制在10%以内，不但从侧面的反映出酶联免疫试剂盒生产技术的成熟，也说明了在试剂因素、样本因素以及人为操作因素操作上严格控制的话实验结果会相对更理想。综上所述，兽医实验室抗体检测结果的准确性直接影响着动物疫病防控的实践，通过在实验过程中加强实验室检测技术的应用能够最大程度上降低试剂因素、样本因素以及人为操作因素对实验结果产生的影响，从而为当前兽医实验室的动物疫病防控工作提供依据。

参考文献：

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