王振宇 钱 祥 张爱琴

1 浙江省杭州市丁桥医院 浙江 杭州 310021

2 浙江省肿瘤医院 浙江 杭州 310022

本研究通过新一代的高通量测序，对肠道菌群进行基因测序，了解原发性肺腺癌患者与健康对照组肠道菌群结构的差异性。

1 材料与方法

1.1 标本采集：选取浙江省肿瘤医院胸部肿瘤外科新入院患者，充分沟通后，签署知情同意书。要求1周内未使用中药制剂、抗生素、类固醇药物、微生态制剂及酸奶等。收集的粪便于省肿瘤医院-80℃保存。剔除各种原因不愿手术，术后病理为炎性病变，术后病理非腺癌粪便标本。取病理确诊为肺腺癌的患者粪便10例，与患者平均年龄相近的正常人粪便10例，用做实验对象。

1.2 粪便DNA提取与16S rRNA PCR扩增及Illumina测序：按TIANamp Stool DNA kit试剂盒说明进行。用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶观察DNA完整性。质检后选取合适DNA样本进行后续分析。

1.3 数据分析：通过生物数据分析进行OTU聚类及注释、Alpha多样性、Beta多样性、群落组成分析、物种丰度差异分析等。

2 结果

2.1 一般资料：入组的10例原发性肺腺癌患者均为男性，年龄42～59岁，平均年龄48.8±6.12岁；健康人群对照组10例均为男性，年龄40～60岁，平均年龄48.7±6.25岁。两组人群年龄、性别比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 样本肠道菌群OTU聚类、注释及维恩图：如图1。每个椭圆代表一个样品(分组)，椭圆间的重叠区域表示样品间（组间）共有的OTUs，每个区域的数字大小表示该区域对应的OTUs数目。可以看出原发性肺腺癌患者与健康人群肠道菌群OTUs总数基本一致，在种类上有一定的重合性，同时存在显著差异。

图1 OTU维恩图

2.3 肠道菌群多样性分析：Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性。常用的多样性度量指数有：群落丰富度指数，包括Chao指数和ACE指数，两指数越大，说明群落丰富度越高。群落多样性指数，包括Shannon指数和Simpson指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。组间t检验P均＞0.05，说明两组样本多样性无显著性差异。见表1。

表1 4个多样性指数组间t检验数据表

Beta多样性是不同生态系统之间多样性的比较，利用各样品序列间的进化及丰度信息来计算样品间距离，反映样品间是否具有显著的微生物群落差异。运用UniFrac分析进行层级聚类得到丛集树状图2。PCoA是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过PCoA可以观察个体或群体间的差异图3。从两图中我们可以看出肺癌患者肠道菌群与健康人组存在显著性差异。图中PCoA Plot12，PCoA Plot13，PCoA Plot23分别是前三个主要成分两两组合，分别进行作图。不同形状的点代表不同环境或条件下的样本组，横、纵坐标轴的刻度是相对距离，无实际意义。

图2 丛集树状图

图3 PCoA图

2.4 两组粪便样本肠道菌群差异分析：基于各分类学水平样品序列数的统计信息，可以比较某一特定物种在两个或多个（组）样品之间丰度的差异情况。根据序列数的统计信息，应用软件mothur中的Metastats命令进行差异分析。q值越小说明P值越准确。结果如表2。Alistipes存在差异性（P＜0.05）。

表2 两组粪便样本肠道菌群差异分析

3 讨论

本实验通过研究肺腺癌患者以及正常人的肠道菌群丰度分布，通过组间对照寻找肺癌患者肠道中的关键菌，结果发现肺癌患者肠道内存在着大量的Alistipes，提示其可能与肺癌的发生发展有密切联系。

大肠与肺在生理上密切相关，又在病理上相互影响，肠道菌群作为肠道的一个重要组成部分，与肺癌也必然存在密切关系。粪便移植和益生菌的补充已被证明能对多种肺部疾病起到积极的疗效。近年肠道菌群也被证明可以提高宿主抗癌免疫反应[1]以及通过调节肿瘤微环境下的骨髓来源的细胞功能发挥抗肿瘤疗效[2]。中医学从表里经入手，通过归经为大肠的药物（如白花蛇舌草、苦杏仁等），对肺癌起到了积极的疗效。

本次实验结果是祖国医学在“肺与大肠相表里”理论正确性上的一个表现。肠道菌群与肺癌被证明存在着非常密切的关系。能否通过改善Alistipes的丰度分布，从而影响肺癌发生发展，对肺癌起到积极的治疗效果，成为肺癌防治的新靶点，从而为肺癌的防治提供了一个新的思路、新靶点和新的技术平台，还有待实验的论证。