杜楠楠 汪引芳 张鹏

[摘要] 长久以来，心血管疾病威胁着人类的生命健康，而心肌梗死是致死率最高的疾病之一，心肌梗死后心肌损伤、凋亡很大程度上影响着患者的生活质量。心肌细胞再生是解决该问题的关键。本文围绕心肌细胞和骨髓间充质干细胞的生理特性，阐述了骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化中相关的信号通路及分子机制，总结了中药在诱导分化中的调控机制和作用特点，以期为中药防治心血管疾病提供参考。

[关键词] 骨髓间充质干细胞;心肌细胞;中药;诱导分化

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（b）-0030-04

[Abstract] For a long time， cardiovascular diseases have threatened human life and health， and myocardial infarction is one of the most lethal diseases. Myocardial injury and apoptosis after myocardial infarction largely affect the quality of life of patients. Cardiomyocyte regeneration is the key to solve this problem. Based on the physiological characteristics of cardiomyocytes and bone marrow mesenchymal stem cells， this paper elaborates the signaling pathways and molecular mechanisms related to the directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes， and summarizes the regulatory mechanism and functional characteristics of traditional Chinese medicine in inducing differentiation， in order to provide reference for the prevention and treatment of cardiovascular diseases by traditional Chinese medicine.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells; Myocardial cells; Chinese medicine; Induced differentiation

近年來，随着人们生活方式的改变，心血管疾病的发病率和死亡率逐年上升，但至今缺乏有效的预防措施及治疗手段。由于心肌细胞（myocardial cells，CM）为终末分化细胞，具有不可再生性，现有疗法并不能从根本上解决坏死心肌修复的问题。干细胞是一类具有长期增殖、自我更新和分化潜能的细胞，为细胞生物工程治疗相关疾病提供了新的思路。目前，干细胞移植成为治疗多种心血管疾病的替代疗法[1-2]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，MSC最初在骨髓中被发现，称为骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）。因其具备多向分化潜能、支持造血和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。

1 BMSCs和CM的生物学特性

BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞，即使连续培养，也不会丧失其正常的核型及端粒酶活性。因其取材方便、扩增能力强、易于体外培养等优点，成为治疗心脏疾患的重要选择。CM又称心肌纤维，具有兴奋收缩的能力。根据它们的组织学特点和功能差异，粗略地将其分为两大类型，一类是普通的CM，执行收缩功能;另一类是特殊分化的CM，组成心脏的传导系统。BMSCs在一定条件下能诱导分化为CM及其他一些组织细胞。现代医学对BMSCs诱导分化为CM进行了大量研究并取得了一定的进展，较常用的诱导剂为5-氮胞苷（5-aza）[3-5]、碱性成纤维细胞生长因子[6-7]及催产素等[8]，但实际应用却因诱导分化水平低、移植后存活率低、细胞毒性大等因素受到限制。

2 BMSC向CM诱导分化的相关信号通路

在BMSCs向CM诱导分化的过程中，一些信号通路发挥着重要的作用。①骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路。心脏发育过程中，BMP信号通路起着非常关键的作用，其能够促进细胞扩散、迁移和旁分泌，保护细胞在缺氧条件下存活。既往研究[9]发现，BMSCs经BMP-2诱导4周后，分化的心肌细胞存活数量明显增多。亦有研究[10]表明，BMSCs经BMP-2诱导可向类心肌细胞分化，对急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）再灌注损伤有一定治疗作用。②Wnt信号通路。Wnt信号通路是干细胞自我更新，分化和发育的重要信号通路。在小鼠BMSCs中过表达miR1-2可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt11、JNK、β-catenin和TCF的表达，促进Nkx2.5、cTnI、GATA4等心脏特异性基因表达，诱导BMSCs向CM分化[11]。5-aza诱导大鼠BMSCs中心肌特异性蛋白心肌肌钙蛋白（cTnT）表达的同时，瞬时受体通道超家族的成员VR1（vanilloid receptor 1）的表达也增高，这些反应与5-aza上调Wnt/β-catenin信号通路有关[12]。③成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号通路。研究[6]表明，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和氢化可的松联合应用可刺激人胸骨BMSCs向CM分化，且诱导效率高于5-aza。FGF2还可协同5-aza诱导BMSCs向CM分化，表现为细胞中Mef2A、Mef2D和基因转录增加，细胞质中游离Ca2+浓度升高，促进早期CM前体的形成，为心肌成形术提供了可能[13]。④Notch信号通路。Notch信号通路是胚胎发生和维持细胞稳态的普遍调控因子。Jagged1为Notch1配体，有报道[14]称，外源性的Jagged1激活Notch1信号通路，促进BMSCs的多谱系分化，推动了向心脏谱系分化的趋势。采用5-aza体外诱导hBMSCs向CM分化，Notch1、GATA结合蛋白-4和Nkx2.5表达上调，提示Notch1信号通路的过表达可能是hBMSCs向CM分化的潜在机制[15]。还有报道[16]在用5-aza体外诱导猪BMSCs向CM分化的过程中，发现Notch4表达下调。

3 中药单体以及单体间联合应用诱导BMSCs向CM分化研究

现代药理学研究[17]表明，有些中药具有预防心肌缺血再灌注损伤和改善心肌缺血的作用。随着中药提纯技术的提高以及血清药理学的不断发展，某些单味中药或中药提取物能有效诱导干细胞定向分化为CM，且无明显毒副作用，这为应用中医药作为CM诱导剂奠定了坚实的基础[18]。

3.1 丹参（Salvia）

丹参主要化学成分包括以丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）为代表的水溶性酚酸类化合物和以丹参酮ⅡA（tanshinone type ⅡA，Tan ⅡA）为代表的脂溶性菲醌类化合物[19]。转化生长因子β1（TGF-β1）是干细胞分化为CM的关键信号因子，TGF-β1和Sal B体外联合运用，可显著促进BMSCs中GATA4和NKx2.5的转录表达，促进BMSCs向CM分化[20]。而Sal-B与BMP-2联合应用也能显著促进BMSCs中心肌特异性标志物的表达，提示BMP-2联合Sal-B促进了BMSCs的心肌分化[21]。而在体大鼠心肌梗死模型中，在心肌梗死区周围进行多点MSC移植并与丹红注射液联合用药，可促进CXC趋化因子受体4（CXCR4）在MSC中的表达，提高心肌基质细胞衍生因子-1的表达，并可抑制AMD3100（SDF1/CXCR4拮抗剂）的抑制作用，提示丹红注射液通过调节SDF1/CXCR4信号通路，提高了CM中MSCs的存活数量[22]。

3.2 黄芪及黄芪甲苷（AST）

黄芪颗粒能显著增加AMI大鼠骨髓中CD54、CD106、CD105、CD117阳性细胞百分数，并增加血液及骨髓中干细胞因子（SCF）的表达水平，表明黄芪能有效动员BMSCs[23]。体外实验[24]发现，AST和Tan ⅡA两者联合诱导的BMSCs均可见cTnT、Cx43阳性表达，提示二者联合可以诱导BMSCs向CM分化，且联合作用高于单一成分。而AST联合5-aza诱导MSCs向心肌样细胞分化，其诱导分化效率显著高于5-aza单独用药。表现为MSCs高效表达cTnT、特异性蛋白结蛋白Desmin及Cx-43，而且诱导后细胞与正常CM不仅形似，反应心脏功能的心钠素（ANP）和环磷酸腺苷（cAMP）mRNA表达水平也显著升高[25]。

3.3 人参皂苷（GS）

人参皂苷Rh2能剂量依赖性促进BMSCs增殖，可能通过增加DNA合成和促进有丝分裂的机制增强催产素诱导BMSCs向CM分化[26]。汪朝暉等[27]采用GS诱导大鼠BMSCs，结果显示诱导后的CM中心肌Desmin、cTnT和肌球蛋白重链（MHC）表达均为阳性，且阳性细胞呈梭形和成纤维细胞样形态，提示GS在体外能诱导BMSCs分化成心肌样细胞。有研究[28]表明，预先给予人参皂苷Rh3注射可对大鼠心肌缺血再灌注心肌损伤起到很好的保护作用，这也可能与其能够减少心肌细胞中氧自由基、上调心肌细胞抗凋亡蛋白Bcl-2以及抑制促凋亡蛋白Bax表达有关。

3.4 三七皂苷

既往研究[29]发现，三七皂苷可显著诱导小型家猪BMSCs中cTnT和β-MHC的表达，提示BMSCs在三七皂苷的定向诱导下可分化为心肌样细胞。杨忠奇等[30]通过对中药进行筛选，发现三七总皂苷也能在体外成功诱导BMSCs分化为CM，且与经典的心肌细胞分化诱导剂5-aza比较，两者转化率差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.5 淫羊藿苷（ICA）

淫羊藿是传统的补阳药，除了补肾壮阳、强劲健骨之外，随着现代药理学的发展，其越来越多的新药理功能被发现。研究[31]发现，把ICA诱导后的BMSCs通过尾静脉注射输入到心梗大鼠体内，能促进BMSCs增殖，还能促进BMSCs中α-MHC、β-MHC mRNA的表达，提高心肌Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的基因表达，使受损的心肌被修复。在ICA诱导小鼠胚胎干细胞分化的研究中发现，由ICA诱导后的早期分化细胞已经有心肌特异性结构蛋白的合成，提示ICA可诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞方向分化[32]。亦有实验[33]证明ICA能促进BMSCs增殖并能协同5-aza诱导BMSCs向CM分化。

3.6 川芎嗪

川芎嗪可剂量依赖性地促进体外培养的BMSCs的增殖，它还可促进BMSCs表达趋化因子SDF-1及其受体CXCR4 mRNA的表达，有助于促进大鼠BMSCs向心肌梗死局部的归巢，但在体外实验并未发现川芎嗪能直接诱导BMSCs向心肌样细胞转化的证据[34]。

3.7 其他中药及复方制剂

关于其他中药或中药单体诱导干细胞分化的报道还有益气活血中药[35]、绞股蓝[36]、丹参注射液[37]、参附注射液[38]、雪莲花[39]、地黄低聚糖[40]等。研究[41]表明，柴胡三参胶囊含药血清在一定条件下能促进BMSCs的增殖，并可能通过p38-MAPK通路介导BMSCs向CM分化。复方丹参滴丸含药血清体外可诱导大鼠BMSCs分化为心肌样细胞，表现为α辅肌动蛋白（α-actinin）、结蛋白和肌球蛋白重链强阳性表达[42]。

4 小结与展望

中药是中华医学的宝贵财富，其内涵博大精深。由于中药的炮制方法讲究，配伍形式多样，服用剂量不同等，导致了中药的双向调节作用，故有些中药对干细胞既有促进分化的作用，同时也有抑制分化的作用[43]。虽然中药在诱导BMSCs向CM分化的研究中取得了良好的效果，但有些问题比较突出，例如尚未建立鉴定BMSCs的统一标准;BMSCs诱导分化为CM及移植后是如何治疗心肌梗死和改善心功能的具体机制尚不明确;由异源细胞分化成的CM是否会导致心律失常等疾病;如何精准地控制BMSCs向CM分化，以及在进行中药复方研究时很难确定有效成分、作用机制和作用靶点等。

中药对干细胞的研究仍处在初级阶段，随着研究的逐渐深入，中药在干细胞领域肯定会有重大发现，将中医药与干细胞移植联系起来，也是中医药走向现代化的重要途径。

[参考文献]

[1]  Fukuhara S，Tomita S，Yamashiro S，et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro [J]. J Thorac Cardiov Sur，2003，125（6）：1470-1480.

[2]  Melo LG，Pachori AS，Kong D，et al. Molecular and cell-based therapies for protection，rescue，and repair of ischemic myocardium - Reasons for cautious optimism [J]. Circulation，2004，109（20）：2386-2393.

[3]  Soltani L，Rahmani HR，Joupari MD，et al. Ovine fetal mesenchymal stem cell differentiation to cardiomyocytes，effects of co-culture，role of small molecules;reversine and 5-azacytidine [J]. Cell Biochem Funct，2016，34（4）：250-261.

[4]  Xing Y，Lv A，Wang L，et al. The combination of angiotensin Ⅱ and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Mol Cell Biochem，2012，360（1/2）：279-287.

[5]  Ling SK，Wang R，Dai ZQ，et al. Pretreatment of rat bone marrow mesenchymal stem cells with a combination of hypergravity and 5-azacytidine enhances therapeutic efficacy for myocardial infarction [J]. Biotechnol Prog，2011，27（2）：473-482.

[6]  Hafez P，Jose S，Chowdhury SR，et al. Cardiomyogenic differentiation of human sternal bone marrow mesenchymal stem cells using a combination of basic fibroblast growth factor and hydrocortisone [J]. Cell Biol Int，2016，40（1）：55-64.

[7]  Zhang GW，Liu XC，Li-Ling J，et al. Mechanisms of the protective effects of BMSCs promoted by TMDR with heparinized bFGF-incorporated stent in pig model of acute myocardial ischemia [J]. J Cell Mol Med，2011，15（5）：1075-1086.

[8]  Ybarra N，Vincent P，Smith LC，et al. Oxytocin improves the expression of cardiac specific markers in porcine bone marrow stem cells differentiation [J]. Res Vet Sci，2015， 98：42-50.

[9]  Wang Y，Zhang G，Wang H，et al. Preinduction with bone morphogenetic protein-2 enhances cardiomyogenic differentiation of c-kit + mesenchymal stem cells and repair of infarcted myocardium [J]. Int J Cardiol，2018，265：173-180.

[10]  苗忠澄，高航.BMP-2預诱导骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死的实验研究[J].解放军医学杂志，2014，39（8）：601-608.

[11]  Shen X，Pan B，Zhou H，et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes is regulated by miRNA-1-2 via WNT signaling pathway [J]. J Biomed Sci，2017，24（1）：29.

[12]  Ren M，Wang T，Huang L，et al. Role of VR1 in the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes associated with Wnt / beta-catenin signaling [J]. Cardiovasc Ther，2016，34（6）：482-488.

[13]  Lobanok ES，Kvacheva ZB，Pinchuk SV，et al. The influence of fibroblast growth factor （FGF2） on cardiomyocytes differentiation of mesenchymal stem cells of bone marrow ex vivo [J]. Biofizika，2014，59（2）：360-368.

[14]  Ding R，Jiang X，Ha Y，et al. Activation of Notch1 signalling promotes multi-lineage differentiation of c-Kit（POS）/NKX2.5（POS） bone marrow stem cells：implication in stem cell translational medicine [J]. Stem Cell Res Ther，2015，6：91.

[15]  Yu Z，Zou Y，Fan J，et al. Notch1 is associated with the differentiation of human bone marrowderived mesenchymal stem cells to cardiomyocytes [J]. Mol Med Rep，2016， 14（6）：5065-5071.

[16]  刘昕超.猪骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞分化过程中Notch4下调[D].北京：北京协和医学院，2009.

[17]  Wang C，Du H，Hou J，et al. Chaihulonggumulitang Shows Psycho-cardiology Therapeutic Effects on Acute Myocardial Infarction by Enhancing Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Mobilization [J]. Sci Rep-Uk，2018，8（1）：3724.

[18]  孙敬和，冼绍祥，黄习文，等.中医药干预骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的研究进展[J].中药新药与临床药理，2012，23（1）：115-118.

[19]  王怡，高秀梅，邢永发，等.丹参酚酸B、丹参酮治疗心血管疾病的药理学研究进展[J].上海中医药杂志，2010， 44（7）：82-87.

[20]  Lv Y，Liu B，Liu Y，et al. TGF-beta1 combined with Sal-B promotes cardiomyocyte differentiation of rat mesenchymal stem cells [J]. Exp Ther Med，2018，15（6）：5359-5364.

[21]  Lv Y，Gao CW，Liu B，et al. BMP-2 combined with salvianolic acid B promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Kaohsiung J Med Sci，2017，33（10）：477-485.

[22]  Chen J，Wei J，Huang Y，et al. Danhong Injection Enhances the Therapeutic Efficacy of Mesenchymal Stem Cells in Myocardial Infarction by Promoting Angiogenesis [J]. Front Physiol，2018，9：991.

[23]  張宝霞，张金生，张阳阳，等.三七总皂苷、红景天苷、黄芪有效组分对心肌梗死大鼠模型骨髓间充质干细胞动员作用研究[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（8）：137-142.

[24]  宋雪云，龙云，谭超，等.黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J].中国组织工程研究，2013，17（36）：6515-6520.

[25]  孙敬和.心肌样微环境下黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导MSCs分化为心肌样细胞[D].广州：广州中医药大学，2012.

[26]  王乐，田立，郑明奇，等.人参皂苷Rh2干预催产素诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的转化[J].中国组织工程研究，2015，19（23）：3633-3638.

[27]  汪朝晖，冼绍祥，杨忠奇，等.人参总皂甙诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J].广州中医药大学学报，2006，23（2）：100-103.

[28]  王俊东，崔勇，王建国，等.人参皂苷Rh3预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究[J].中华中医药学刊，2017，35（11）：2783-2786.

[29]  孔晓丹，曲鹏，王彦，等.三七皂甙诱导骨髓基质细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J].中国心血管病研究杂志，2005，3（7）：528-530.

[30]  杨忠奇，冼绍祥，汪朝晖，等.三七总皂苷对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用[J].中药新药与临床药理，2006，17（4）：239-242.

[31]  谢玲玲.淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的实验研究[D].广州：广州中医药大学，2008.

[32]  孫晓冬，董韬，于宏伟，等.淫羊藿苷体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞[J].解剖科学进展，2011，17（2）：124-127.

[33]  刘韶英.淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖及向心肌细胞分化的影响[D].北京：北京中医药大学，2008.

[34]  戴儒丽.川芎嗪对骨髓间质干细胞增殖、SDF-1mRNA表达及向心肌样细胞分化的实验研究[D].广州：广州中医药大学，2010.

[35]  谢娟.益气活血中药对骨髓间充质干细胞向缺血心肌迁移的影响及其机制研究[D].西安：第四军医大学，2012.

[36]  陈梅，王立新.中药联合干细胞疗法治疗缺血性脑卒中的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（19）：218-226.

[37]  林惠.丹参注射液干预脑梗死大鼠SVZ干细胞增殖作用的研究[D].长沙：湖南中医药大学，2014.

[38]  李荣，王向培，王创畅，等.参附注射液预处理对5-氟胞苷体外诱导兔骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验研究[J].中药新药与临床药理，2015，26（6）：765-770.

[39]  张爱国，蔡建平，谭湘陵，等.五种中药对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的作用[J].辽宁中医杂志，2012，39（1）：158-161.

[40]  王新华，王士雯，李泱，等.地黄低聚糖诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[J].解放军医学杂志，2009，34（4）：412-414.

[41]  雷娄芳.柴胡三参胶囊含药血清对P38MAPK通路介导BMSCs向心肌细胞分化的干预研究[D].长沙：湖南中医药大学，2017.

[42]  武重阳，孙兰军，赵英强，等.复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[J].中国老年学杂志，2010，30（16）：2328-2330.

[43]  李伟娟，谢保平，石丽颖，等.从ERα/RANK通路探讨淫羊藿苷抑制破骨细胞分化作用[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（7）：121-126.

（收稿日期：2019-02-20  本文编辑：王   蕾）