徐微 刘雅雯 龚爱华

[摘要] 长链非编码RNA（lncRNA）在许多人类癌症中失调，包括结肠直肠癌（CRC），它是世界上第三大常见的癌症，与预后不良有关;与此同时，一些lncRNA作为抑癌基因或致癌基因参与CRC的发生发展，在诊断、治疗及预后方面具有重要价值。lncRNA可以以微泡、外泌体或蛋白质复合物的形式进入人体循环系统，形成稳定的循环lncRNA，且其浓度水平在健康受试者和患者之间存在差异，可以作为一种新颖、易于获取、无创的检测工具。本文简要回顾近年来关于循环lncRNA生物学特性的研究进展，着重分析了循环lncRNA作为结肠直癌筛查和预后监测生物标志物的潜在应用。

[关键词] 循环;长链非编码RNA;外泌体;结直肠癌;分子诊断

[中图分类号] R574.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（b）-0026-05

[Abstract] Long noncoding RNA （lncRNA） is dysregulated in many human cancers， including colorectal cancer （CRC）， which is the third most common cancer in the world and is associated with poor prognosis; at the same time， some lncRNAs are involved in the development of CRC as tumor suppressor genes or oncogenes and are of great value in diagnosis， treatment and prognosis. LncRNA can enter the human circulatory system in the form of microbubbles， exosomes or protein complexes， forming stable circulating lncRNA. Its concentration level is different between healthy subjects and patients， which can be used as a novel， affordable， lightly accessible， non-invasive detection tool. This article briefly reviews recent advances in the biological properties of circulating lncRNA， focusing on the potential applications of circulating lncRNA as a biomarker for colorectal cancer screening and prognosis monitoring.

[Key words] Circulating; Long noncoding RNA; Exosome; Colorectal cancer; Molecular diagnosis

据世界卫生组织统计，结直肠癌（CRC）是全球男性和女性中第三大常见的癌症，在癌症患者死亡中排名第二[1]。结肠镜检查是CRC筛查的金标准，然而，由于其价格昂贵，需要预先进行肠道准备，有肠穿孔等并发症，或者患者肛管直肠狭窄，有腹膜刺激症状、严重心肺功能等基础疾病，因此不能作为一些参与者的筛查或者初始测试[2-3]。此外，目前已知的肿瘤生物标志物如癌胚抗原（CEA）和CA125尚未充分显示出对检测癌前病变和早期肿瘤足够的敏感性和特异性。近年来，检测癌症患者体液中与癌症相关的长链非编码RNA（lncRNA）已被证明是一种特别有价值的诊断癌症的方法。与传统的肿瘤组织活检比较，循环lncRNA在肿瘤诊断和预后方面具有更大的优势，尤其是其非侵袭性，在临床常规应用方面具有很大的潜力[4-6]。因此，本文在讨论循环lncRNA分泌机制的基础上，重点综述其在CRC诊断、治疗和预后中的潜在应用。

1 循环LncRNA简介

人类基因组广泛转录，蛋白质编码基因却只占其中的2%，绝大多数转录本是非编码RNA（ncRNAs），对细胞生长或疾病发展方面发挥着巨大的作用[7]。NcRNAs分为短链非编码RNA（20～200 nt）和长链非编码RNA（200 nt～10 kb）。lncRNA占ncRNAs的80%以上[8]，作为功能性RNA，可以调节其他ncRNA的活性，特别是微小RNA（miRNA），通过充当“海绵”，将miRNA远离天然mRNA靶标（从而充当竞争性内源RNA，ceRNA）。但其作为非编码RNA仍然存在争议，最近的分析表明核糖体可参与一些lncRNA的调节过程，生成小肽[9]。lncRNA的表达模式也非常特殊，可分为正义lncRNA（sense lncRNA）、反义lncRNA（antisense lncRNA）、双向lncRNA（bidirectional lncRNA）、基因间lncRNA（intergenic lncRNA）、基因内lncRNA（intronic lncRNA）[10]。目前，虽然尚未完全了解lncRNA释放到细胞外环境中的确切机制，但已有研究[11-12]表明，一些lncRNA可以以稳定形式存在于血清、血浆和其他体液中，不受内源性RNA酶的影响。因此，循环lncRNA水平非常适合于患者样本的非侵入性分析。

1.1 循環lncRNA生物学特性

lncRNA作为癌症诊断和预后生物标志物的主要优势之一，是其在体液循环中的高稳定性，尤其是在外泌体中[13]。外泌体是50～150 nm大小的脂质双层胞外囊泡（EVs），含有核酸（mRNA、ncRNA和DNA）、蛋白质和脂质，由多种细胞类型释放，被认为在包括癌症在内的许多疾病中发挥作用[14-15]。外泌体中包裹的lncRNA可通过脂质双层保护其不被降解，此外，工程化的外泌体可作为靶向递送干扰RNA（RNAi）分子的治疗载体，避开免疫系统的检测[16]。这些标志物具有微创性，患者对lncRNA的耐受性更好。例如，Wang等[17]研究发现，外泌体HOTAIR的表达能够区分声带息肉和喉部鳞状细胞癌，敏感性为92.3%，特异性为57.2%，但结合miR-21，分别提高到94.2%和73.5%。此外，Ren等[18]发现，癌相关成纤维细胞CAF通过转移外泌体lncRNA H19促进结直肠癌的干性和化疗抗性。

1.2 循环lncRNA在肿瘤耐药性方面的研究进展

耐药性往往是临床化疗失败的主要原因。舒尼替尼耐药是治疗晚期肾细胞癌（RCC）的主要困难。Le等[19]确定了一种lncRNA——lncARSR（在具有舒尼替尼抗性的RCC中激活的lncRNA），其与临床上不良的舒尼替尼反应相关。lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449，促进RCC细胞中的跨膜受体酪氨酸激酶AXL和c-MET表达，从而促进舒尼替尼耐药。此外，lncARSR可以分泌到外泌体中并传递给敏感细胞，从而传播舒尼替尼耐药性。用靶向lncARSR或AXL/c-MET抑制剂锁定核酸治疗，使对舒尼替尼耐药的RCC恢复了对舒尼替尼的反应。因此，lncARSR有可能作为舒尼替尼耐药的预测因子和潜在治疗靶点。最近，另外一项研究[20]发现，删除裂殖酵母中的一组基因间lncRNAs显示出明显的细胞表型——药物敏感性。对受影响基因的详细分析显示，lncRNA nc-tgp1的转录通过抑制邻近的磷酸酯反应酶基因——甘油磷酸二酯转运体1[tgp1（+）]来调节药物耐受性，lncRNA的转录控制裂殖酵母中的药物耐受性。这表明癌细胞可能利用外泌体衍生的lncRNA来改善化疗耐药性。目前，用于治疗CRC患者的化疗药物毒性高，疗效因患者而异，特别是存在化疗药物耐药性，针对这一点，临床迫切需要开发工具，可以帮助判断哪些患者适合特定的药物，以及降低耐药性。

2 结直肠癌中循环lncRNA的重大发现

结肠癌相关转录本1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）位于MYC癌基因的上游，一个被称为超级增强子的区域[21]。He等[22]发现CRC患者血浆中CCAT1水平明显高于健康对照组，其过表达与CRC的增殖、侵袭性、临床分期、淋巴结转移及存活时间相关。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是第一个被发现具有反转录调控功能的lncRNA。已被证明降低HOTAIR的表达可以抑制人CRC干细胞的生长[23]，其不仅在CRC患者的原发性肿瘤中高度表达，在外周血中也存在[24]。Zhao等[25]检测发现HOTAIR和CCAT1在CRC患者血浆中表达上调，而lncRNA-p21的表达水平明显降低。术后14 d CCAT1和HOTAIR的血浆表达水平较术前明显降低，lncRNA-p21的表达水平则显著增加。提示这3种lncRNA的表达量高度相关，联合可提高对CRC的诊断效能。

细胞外囊泡是由细胞释放到体液中小的磷脂包绕的囊泡，根据大小和直径进行分类，包括AB（50～5000 nm）、MV（50～1000 nm）和EXO（40～100 nm）[26-27]。Dong等[27]收集76例術前CRC患者、76例年龄和性别匹配的健康受试者和20例结直肠腺瘤患者的血清，采用qPCR方法检测了79个与癌症相关的长链RNA在这三种囊泡中的分布，发现长链RNA的含量在3种细胞外囊泡中具有不同的分布。大多数mRNA和lncRNA在EXO中含量最高，而在MV含量最低，进一步研究发现，2种mRNA（KRTAP5-4和MAGEA3）以及lncRNA（BCAR4）的组合具有最佳诊断能力（AUC = 0.936），且血清EXOs中这3种基因的数量在结直肠腺瘤患者与健康受试者有显着差异。Dong等[27]再次比较了血清总RNA和EXO中的RNA对预测结直肠癌特异性和敏感性的差异，发现相同样本总血清RNA的AUC低于外泌体RNA，提示人体循环体液中外泌体这一载体介质所包含的RNA作为生物标志物对检测癌症具有重要价值。

Wang等[28]使用微阵列分析和qRT-PCR方法确定了1种在CRC患者血浆中表达上调的lncRNA（BANCR）和3种表达下调的lncRNA（NR_026817，NR_029373和NR_034119），然后通过严格的逐步选择程序成功建立了一种独特的血清4-lncRNA组合用于CRC的检测。进一步Kaplan-Meier生存分析发现NR_029373和NR_034119可作为CRC特异性生存率的独立预测因子，是预测CRC预后的潜在生物标志物。同时还证实了即使经室温放置和反复冻融，4条lncRNAs在血清中仍稳定存在。

LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061组成的3-lncRNA模型可作为CRC的诊断指标，其对CRC的诊断能力明显高于CEA、CA199、CA125和CA724，且联合检测可大大提高诊断能力。Wang等[29]运用qRT-PCR方法检测了71例CRC患者和70名健康人血清中17种与CRC相关的lncRNAs水平，其中lncRNA LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061在CRC患者与健康对照组之间表达差异显著，同期对比30例CRC患者手术前后血清中3种lncRNAs的水平，发现术后较术前显著下降。

HOTAIRM1位于人类HOXA1和HOXA2基因之间，可能作为一种髓系特异性lncRNA，在骨髓形成过程中发挥调控基因表达的作用[30]。Wan等[31]发现与匹配的正常结肠组织比较，CRC患者组织和血浆中lncRNA HOTAIRM1的表达水平低于对照组，敲低HOTAIRM1导致与细胞增殖相关基因表达明显变化并促进细胞增殖，表明其在CRC中起着抑癌作用，进一步研究发现，联合检测HOTAIRM1和CEA可将敏感性由原来的64.00%提高到84.00%，但不影响特异性。因此HOTAIRM1的下调可以作为CRC的生物标志物。最后在所有血浆样本中（训练组和验证组）分析并建立ROC曲线，评估HOTAIRM1、CEA、CA19-9和CA125的敏感性和特异性，并比较其诊断CRC的能力，发现HOTAIRM1与CEA高度相似，优于CA19-9和CA125。

目前，CRC患者血浆中lncRNA—XLOC_ 006844、LOC152578和XLOC_000303Shi上调有助于CRC的诊断。Shi等[32]使用lncRNA微阵列，通过多阶段验证和风险评分公式检测筛选CRC的潜在生物标志物，发现CRC中有3个lncRNA—XLOC_006844、LOC152578和XLOC_000303与健康对照组相比显著上调，在训练集和验证集下合并面积（AUC）分别为0.919和0.975，然后通过双盲及稳定性表达验证试验发现，XLOC_006844、LOC152578和XLOC_000303 3条lncRNAs组合能从100例血浆样品中分辨出50例CRC患者的准确率达85%，且在室温下对这3个lncRNAs进行了12、24 h的扩增，或者对其进行3个循环的冷冻和解冻，结果显示所有的过程对这3种物质浓度几乎没有影响，提示这3种lncRNAs在血浆中可稳定存在。Yue等[33]的研究检查了150份血液样本，其中50份来自术前结肠癌患者，50份来自术后1个月的患者，50份来自健康的个体。结果发现，术前患者和健康人的循环lncRNA FER1L4水平无差异，但术后1个月结肠癌患者循环FER1L4水平降低了70%（35/50）。

3 局限性及未来发展方向

已证明lncRNA的失调会改变各种癌症相关的信号通路，而且循环lncRNA的稳定性、与CRC的关系以及易于获得等特点都表明其具有较强的临床应用前景，可用实时荧光、高通量测序、基因芯片等常用测序技术[34-35]，但某些局限性仍阻止了它们在临床中的应用。第一，循环lncRNA转录水平及其转录后修饰是不稳定和可变的，甚至在疾病的不同阶段难以检测。第二，在内源性控制中，对于循环lncRNA的量化没有一个简单的标准分析或共识。第三，获得的大多数结果没有被复制，需要在多个中心和不同人群的大规模验证中得到证实。第四，很难确定已分离和量化的循环lncRNA的来源，因此很难确定这些lncRNAs是由肿瘤组织的细胞分泌出来的，还是由于血细胞污染而被检测出来的。循环lncRNAs在CRC中的诊断效率见表1。

4 总结

CRC的发生发展遵循一个循序渐进的过程，即正常的结肠上皮转化为腺瘤性息肉，然后发展为恶性肿瘤，其治疗取决于临床病理特征，包括TNM分期、组织学和肿瘤边缘浸润。血清中独立或多种lncRNA的组合是筛选CRC及监测预后的一种新的补充方法，可能提高临床应用中CRC的诊断能力，为今后的研究提供新的方向，如循环lncRNA的来源、功能和临床价值等。

[参考文献]

[1]  Bray F，Ferlay J，Soerjomataram I，et al. Global cancer statistics 2018：Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2]  Liang PS，Dominitz JA. Colorectal Cancer Screening：Is Colonoscopy the Best Option？ [J]. Med Clin N Am，2019， 103（1）：111-123.

[3]  Atkin W，Wooldrage K，Parkin DM，et al. Long term effects of once-only flexible sigmoidoscopy screening after 17 years of follow-up：The UK Flexible Sigmoidoscopy Screening randomised controlled trial[J]. Lancet，2017， 389（10076）：1299-1311.

[4]  李江，史征，羅天航，等.胃癌患者癌组织及血浆中长链非编码RNAXIST的表达与临床意义[J].第二军医大学学报，2017（11）：60-66.

[5]  Zhang K，Shi H，Xi H，et al. Genome-Wide lncRNA Microarray Profiling Identifies Novel Circulating lncRNAs for Detection of Gastric Cancer [J]. Theranostics，2017，7（1）：213-227.

[6]  Ferracin M，Lupini L，Mangolini A，et al. Circulating Non-coding RNA as Biomarkers in Colorectal Cancer [J]. Adv Exp Med Biol，2016，937：171-181.

[7]  Qian X，Zhao J，Yeung PY，et al. Revealing lncRNA Structures and Interactions by Sequencing-Based Approaches [J]. Trends Biochem Sci，2019，44（1）：33-52.

[8]  Matsui M，Corey DR. Non-coding RNAs as drug targets [J]. Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：167-179.

[9]  Marchese FP，Raimondi I，Huarte M. The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function [J]. Genome biol，2017，18（1）：206-246.

[10]  Quinn JJ，Chang HY. Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function [J]. Nat Rev Genet，2016， 17（1）：47-62.

[11]  Shi T，Gao G，Cao Y. Long Noncoding RNAs as Novel Biomarkers Have a Promising Future in Cancer Diagnostics [J]. Dis Markers，2016，2016：9085195.

[12]  Anfossi S，Babayan A，Pantel K，et al. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update [J]. Nat Rev Clin Oncol，2018，15（9）：541-563.

[13]  Fan Q，Yang L，Zhang X，et al. The emerging role of exosome-derived non-coding RNAs in cancer biology [J]. Cancer Lett，2018，414：107-115.

[14]  Hessvik NP，Llorente A. Current knowledge on exosome biogenesis and release [J]. Cell Mol Life Sci，2018，75（2）：193-208.

[15]  Tkach M，Théry C. Communication by Extracellular Vesicles：Where We Are and Where We Need to Go [J]. Cell， 2016，164（6）：1226-1232.

[16]  Milane L，Singh A，Mattheolabakis G，et al. Exosome mediated communication within the tumor microenvironment [J]. J Control Release，2015，219：278-294.

[17]  Wang J，Zhou Y，Lu J，et al. Combined detection of serum exosomal miR-21 and HOTAIR as diagnostic and prognostic biomarkers for laryngeal squamous cell carcinoma [J]. Medical Oncology，2014，31（9）：148.

[18]  Ren J，Ding L，Zhang D，et al. Carcinoma-associated fibroblasts promote the stemness and chemoresistance of colorectal cancer by transferring exosomal lncRNA H19 [J]. Theranostics，2018，8（14）：3932-3948.

[19]  Le Qu，Ding J，Chen C，et al. Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA [J]. Cancer cell，2016，29（5）：653-668.

[20]  Ard R，Tong P，Allshire RC. Long non-coding RNA-mediated transcriptional interference of a permease gene confers drug tolerance in fission yeast [J]. Nat Commun，2014，5：5576.

[21]  Xiang JF，Yin QF，Chen T，et al. Human colorectal cancer-specific CCAT1-L lncRNA regulates long-range chromatin interactions at the MYC locus [J]. Cell Res，2014，24（5）：513-531.

[22]  He X，Tan X，Wang X，et al. C-Myc-activated long noncoding RNA CCAT1 promotes colon cancer cell proliferation and invasion [J]. Tumour Biol，2014，35（12）：12 181-12 188.

[23]  Dou J，Ni Y，He X，et al. Decreasing lncRNA HOTAIR expression inhibits human colorectal cancer stem cells [J]. Am J Transl Res，2016，8（1）：98-108.

[24]  Svoboda M，Slyskova J，Schneiderova M，et al. HOTAIR long non-coding RNA is a negative prognostic factor not only in primary tumors，but also in the blood of colorectal cancer patients [J]. Carcinogenesis，2014，35（7）：1510-1515.

[25]  Zhao W，Song M，Zhang J，et al. Combined identification of long non-coding RNA CCAT1 and HOTAIR in serum as an effective screening for colorectal carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（11）：14 131-14 140.

[26]  Schlosser K，Hanson J，Villeneuve PJ，et al. Assessment of Circulating LncRNAs Under Physiologic and Pathologic Conditions in Humans Reveals Potential Limitations as Biomarkers [J]. Sci Rep，2016，6：36596.

[27]  Dong L，Lin W，Qi P，et al. Circulating Long RNAs in Serum Extracellular Vesicles：Their Characterization and Potential Application as Biomarkers for Diagnosis of Colorectal Cancer [J]. Cancer Epidemiology Biomarkers Prevention，2016，25（7）：1158-1166.

[28]  Wang R，Du L，Yang X，et al. Identification of long noncoding RNAs as potential novel diagnosis and prognosis biomarkers in colorectal cancer [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2016，142（11）：2291-2301.

[29]  Wang C，Yu J，Han Y，et al. Long non-coding RNAs LOC285194，RP11-462C24.1 and Nbla12061 in serum provide a new approach for distinguishing patients with colorectal cancer from healthy controls [J]. Oncotarget，2016，7（43）：70769-70778.

[30]  Zhang X，Lian Z，Padden C，et al. A myelopoiesis-associated regulatory intergenic noncoding RNA transcript within the human HOXA cluster [J]. Blood，2009，113（11）：2526-2534.

[31]  Wan L，Kong J，Tang J，et al. HOTAIRM1 as a potential biomarker for diagnosis of colorectal cancer functions the role in the tumour suppressor [J]. J Cell Mol Med，2016， 20（11）：2036-2044.

[32]  Shi J，Li X，Zhang F，et al. Circulating lncRNAs associated with occurrence of colorectal cancer progression [J]. Am J Cancer Res，2015，5（7）：2258-2265.

[33]  Yue B，Sun B，Liu C，et al. Long non-coding RNA Fer-1-like protein 4 suppresses oncogenesis and exhibits prognostic value by associating with miR-106a-5p in colon cancer [J]. Cancer Sci，2015，106（10）：1323-1332.

[34]  Nikolaou S，Qiu S，Fiorentino F，et al. Systematic review of blood diagnostic markers in colorectal cancer [J]. Tech Coloproctol，2018，22（7）：481-498.

[35]  Zhang Y，Tao Y，Liao Q. Long noncoding RNA：A crosslink in biological regulatory network [J]. Brief Bioinform，2018，19（5）：930-945.

（收稿日期：2019-02-25  本文編辑：封   华）