刘雨薇，曲艺，颜晓菁

（中国医科大学附属第一医院血液科，沈阳 110001）

成人急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病［1］。临床上超过50%的成人ALL患者化疗后不缓解或者缓解后复发，且一旦复发再次完全缓解率低，患者总体预后不良［2］。目前，其分子机制尚未完全明确。亟需对ALL发病机制进行深入研究，以寻找新的分子标志物和潜在治疗靶点。

乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）家族是一类依赖NAD（P）+来催化内源性和外源性的醛氧化成为相应羧基酸的酶。在人体中发现该蛋白质超家族由19个成员组成［3］，定位在不同的染色体上。ALDH基因家族广泛参与体内各种脂类的代谢，可以降解细胞内有毒物质，对细胞有保护作用［4-6］。同时，ALDH基因家族还被证实与恶性疾病的发生密切相关［7-12］。

ALDH3B1是ALDH的家族成员，其编码基因位于11q13.2，编码蛋白长度为52×103［9-11］。目前ALDH3B1的研究相对较少，其功能尚不清楚，与细胞内活性氧的清除及维甲酸代谢相关［12-14］。本研究拟明确ALDH3B1基因在ALL患者中的表达情况，并对其临床意义进行分析，进而初步探索其在ALL细胞系中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象和临床数据采集

纳入2012年1月至 2016年2月在中国医科大学附属第一医院血液科初诊的43例ALL患者（ALL组），经过骨髓细胞形态学及免疫分型等检查确诊为ALL，均为 L2 型。其中T淋巴细胞白血病（T-ALL）5例，B淋巴细胞白血病（B-ALL）38例，男∶女=23∶20，平均年龄 40.1（16～67）岁。收集患者的临床信息。实验室检查包括初诊时骨髓中原始细胞数、外周血白细胞数、中性粒细胞数、血红蛋白含量、血小板数、染色体核型分析、融合基因检测结果、二代测序结果。临床治疗情况包括是否达到完全缓解、治疗方案（包括造血干细胞移植）、复发情况、生存时间等。选择同期20例非造血系统恶性疾病患者作为对照组，男∶女=5∶15，平均年龄 50.8（16～73）岁。分离患者骨髓单个核细胞，提取RNA进行检测。用于研究的骨髓细胞均来自临床检验的剩余标本，且均获得了患者的知情同意。

1.2 主要试剂

高效 cDNA逆转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司，SYBR Premix Ex Taq购自日本TaKaRa公司。人ALL细胞系Jurkat、Molt-4购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，骨架质粒、Transfect慢病毒包装试剂、聚凝胺购自中国和元生物技术（上海）有限公司。嘌呤霉素购自美国Solarbio公司，纤连蛋白购自美国EMD Milipore公司，CCK-8购自日本同仁。抗体：ALDH3B1购自美国Thermo公司，GAPDH和二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。PVDF膜、ECL检测发光试剂盒购自美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取及cDNA逆转录：采用TRIzol Reagent法提取总 RNA。根据测定浓度将RNA均稀释至200 ng/μL，根据试剂盒逆转录反应合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 实时定量PCR：ALDH3B1引物，上游序列5’-C ATCCTGCCCATCGTGAA-3’，下游序列5’-GTGCATG AAGCCGTCGTT-3’，产物长度为169 bp。GAPDH引物，上 游 序 列5’-TTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游序列5’-CTGTGGTCATGAGTCCTT-3’，产物长度为142 bp。按照 SYBR Premix Ex Taq 的说明配制定量 PCR 反应体系。PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40 个循环。反应结束后，从程序中读取Ct值。计算2-△△Ct进行相对定量，△Ct=CtALDH3B1-CtGAPDH。

1.3.3 细胞培养：ALL细胞系Jurkat、Molt-4、BALL-1培养于含10%胎牛血清的 1640培养液。293T细胞系培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液。培养条件：37 ℃、5% CO2培养，根据细胞密度进行传代。

1.3.4 ALDH3B1病毒的制备：空载质粒H149 pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，过表达质粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-ALDH3B1-3Flag，293T细胞转染前1 h换用Opti-MEM培养基，将制备好的包装试剂和质粒复合物（骨架质粒∶穿梭质粒=1∶1）加入培养基静置20 min后加入细胞培养基中，37 ℃孵育6～8 h后吸去培养基，PBS洗涤后加入新鲜培养基。转染后48和72 h收集上清，上清液3 500 r/min离心10 min，弃掉沉淀后用0.22 μm滤膜过滤，30 000 r/min、4 ℃离心2 h，弃上清，用100～200 μL培养预冷的 DPBS重悬，4 ℃过夜，分装后测滴度。

1.3.5ALDH3B1稳定过表达细胞系的建立：Jurkat细胞系以1×105/mL的密度按照最适感染复数MOI加入病毒，加入聚凝胺（终浓度为5 μg/mL）转染，转染后细胞培养72～96 h后用嘌呤霉素（最适浓度为3 μg/mL）筛选稳定株。培养1个月后用实时定量PCR和Western blotting法验证稳定细胞系中ALDH3B1的表达情况。

1.3.6 细胞增殖实验：以1×105/mL的密度接种细胞至96孔板，于0、24、48、72 h每孔加入CCK-8试剂 10 μL，孵育90 min后测450 nm吸光度（optical density，OD），OD值与活细胞数成正比。

1.4 统计学分析

按照ALDH3B1表达量从高到低排序，以总例数的75%为界分为高表达组和低表达组，实验结果采用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析，采用单因素方差分析和非配对t检验比较各组间的差异，采用生存曲线比较生存时间。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH3B1基因的表达情况和临床数据分析

检测初发ALL组45例患者和对照组20例非造血系统恶性疾病患者骨髓单个核细胞中ALDH3B1基因的表达水平，结果显示，初发ALL组患者中ALDH3B1的表达水平明显低于对照组（P=0.000 6），见图1。

进一步分析ALL患者中ALDH3B1的表达水平与临床特征的相关性。以患者初诊时白细胞数＞30×109/L（B-ALL）或＞100×109/L（T-ALL）为高白细胞血症，结果显示，高白细胞血症患者ALDH3B1基因的表达水平低于非高白细胞血症患者（P=0.035 8）。20例ALL患者在我院治疗并且获得随访信息，其中16例缓解后复发，复发患者ALDH3B1基因的表达水平较未复发患者降低（P=0.046 2）。见表1。

图1 2组患者ALDH3B1的表达Fig.1 ALDH3B1 expression in the two groups

表1 ALL患者的临床特征与ALDH3B1基因表达的相关性Tab.1 Correlation between the clinical characteristics of patients with acute lymphoblastic leukemia and the expression of ALDH3B1 gene

急性白血病患者初始时白细胞数量增高以及疾病复发是预后不良的指标，本研究分析了ALDH3B1基因表达水平和患者生存情况的关系，以总例数的75%作为分界，将患者分为高表达组和低表达组，生存时间按照随访时生存天数计算。结果发现，ALDH3B1低表达患者生存时间明显低于高表达患者（P=0.034 1，图2），提示ALDH3B1低表达是一个预后不良的标志。

2.2 ALDH3B1基因在ALL发病中的初步功能学研究

图2 ALDH3B1表达水平与总生存时间的关系Fig.2 Relationship between ALDH3B1 expression and overall survival time

本研究首先检测了不同ALL细胞系中ALDH3B1基因的表达情况（图3），结果发现T-ALL细胞系Jurkat和Molt-4以及B-ALL细胞系BALL-1中ALDH3B1基因表达水平均较对照组降低（P＜0.05）。且T-ALL细胞系ALDH3B1基因表达水平较B-ALL细胞系更低（P＜0.05）。

图3 ALL细胞系中ALDH3B1的表达水平Fig.3 ALDH3B1 expression levels in acute lymphoblastic leukemia cell lines

然后本研究构建了ALDH3B1过表达质粒并包装了过表达病毒，建立了ALDH3B1稳定过表达的Jurkat细胞系，采用实时定量PCR和Western blotting检测ALDH3B1的表达情况，结果发现，过表达细胞系ALDH3B1的表达水平较空载对照组明显增加（图4）。随后，本研究用建立的稳定细胞系进行了初步的功能性研究，采用CCK-8方法检测细胞的增殖情况，结果显示，过表达组细胞增殖在48和72 h均明显低于空载对照组和空白对照组（均P＜0.05，图5）。

图4 在Jurkat细胞中验证ALDH3B1过表达Fig.4 Verification of ALDH3B1 overexpression in Jurkat cells

图5 过表达ALDH3B1对Jurkat细胞增殖的影响Fig.5 Effect of ALDH3B1 overexpression on the proliferation of Jurkat cells

3 讨论

ALL发病年龄呈双峰，集中在儿童期和50岁左右。ALL儿童常规化疗效果明显好于成人，5年总生存率约为90%。ALL成人患者总体疗效相对较差，近年来随着儿童化疗方案在成人中的应用，靶向治疗和移植技术的进展，成人ALL的预后已经得到改善，患者完全缓解率较高，但仍有相当多的患者出现复发和耐药，5年生存率仅为30%～40%［2］。因此，需要进一步研究ALL发生、发展的分子机制，为诊治和判定预后提供新的分子标志。

ALL是一种起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，但其发病机制尚不明确。代谢异常现在被认为是癌症的特征之一，肿瘤代谢谱检测或者某些调节代谢的基因可以用于肿瘤患者的诊断、疗效评估和预后判定，亦可用于癌症的治疗，针对信号转导途径或酶机制设计靶向治疗药物［1］。前期研究发现，一种编码醛脱氢酶超家族成员之一的基因ALDH3B1在ALL中表达减低，且与患者初诊时白细胞数量增高有关，目前认为成人ALL的不良预后与患者诊断时白细胞数高、混合系白血病基因阳性［如t（4；11）］、Ph染色体阳性、亚二倍体等［1］有关。与此一致，本研究结果显示ALDH3B1低表达的患者复发率更高，长期生存时间更短，提示ALDH3B1低表达可以作为一个有效的预后判定分子标志。但因病例数较少，ALDH3B1表达水平与ALL患者染色体异常以及基因突变之间的关系本研究并未分析，需要进一步扩大样本加以研究。本研究结果也提示，ALDH3B1可能作为抑癌基因参与了白血病的发生发展。

ALDH超家族蛋白广泛参与体内各种脂类、氨基酸和抗体的代谢，参与内、外源性醛与其相应酸的不可逆氧化反应。ALDH基因家族还被证实与恶性疾病的发生密切相关，如ALDH2与再生障碍性贫血、白血病的进展相关［7］。但ALDH3B1与肿瘤的关系目前尚不清楚。本研究通过初步的功能学研究发现，过表达ALDH31确实可以抑制白血病细胞的增殖，其分子机制有待于进一步研究。有研究［14］表明，ALDH3B1与活性氧代谢相关，活性氧在生物体中不断产生，无法处理活性氧负担会增加氧化应激，从而导致蛋白质和DNA的改变，细胞磷脂的脂质过氧化，能产生超过200种反应性醛，而ALDH可以通过代谢多种醛类减弱氧化应激。因此可以推测，ALDH3B1表达增高，可能通过代谢细胞内产生的反应性醛影响白血病细胞的抗氧化应激能力，从而影响细胞的活性，其具体分子机制需要进一步研究。

总之，本研究表明ALDH3B1可能参与了ALL的发病过程，且可以作为一个新的潜在分子标志物用于ALL的诊断和预后判定。