刘舒畅，赖光锐，赵彦艳

（中国医科大学附属盛京医院临床遗传科，沈阳 110004）

染色体异常是导致新生儿缺陷的重要原因之一，可通过早期产前检查发现。目前，临床中常用的产前筛查方法，如“唐氏筛查”，虽然廉价，但检出率低、假阳性率高；超声遗传标记物筛查不能判断胎儿是否有染色体异常；无创产前检测技术虽然准确性高，但是费用昂贵，且对检查技术要求较高，尚不能广泛应用［1］。

文献［2］显示，通过羊水穿刺行产前诊断发现的染色体异常约占5%～10%。目前，检测胎儿染色体异常的方法主要有绒毛穿刺取样、羊膜腔穿刺术和脐血管穿刺取样等介入性方法，其中以羊膜腔穿刺术最为常见。而羊水细胞染色体核型分析作为产前诊断的“金标准”现在被广泛应用于临床，然而该方法检测周期长，技术相对复杂，有培养失败的风险［3］。因此，临床上亟需寻找一种能快速进行羊水标本核型分析的检查方法。

液相色谱-串联质谱技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是 近20年来快速发展并成为临床检验领域最富有生命力的新技术之一，该技术具有廉价、快速、检测种类多样的特点。由于某些染色体异常可以引起某种蛋白质或者酶的异常，因此，通过LC-MS/MS测定羊水中某些氨基酸或肉碱的值，可能提示胎儿某些染色体异常。目前，LC-MS/MS的应用已从食品、药物成分分析领域，扩展到遗传病的产前筛查中［4-5］。因此，本研究采用LC-MS/MS技术检测羊水中氨基酸和肉碱的含量，并结合已知羊水染色体检查结果进行样本间比较，旨在探索新的羊水标记物，为临床产前筛查提供新方法、新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组

选择2017年10月至2018年2月于我院羊水穿刺门诊行超声引导下羊膜腔穿刺术的孕妇1 044例。年龄17～48岁，平均（31.5±5.34）岁；孕周16周+6 d～28周，平均（20.37±4.11）周。所有研究对象均同意检查并签署知情同意书。根据纳入标准和排除标准，最终共筛选出符合条件者513例，其中羊水检查结果正常439例（染色体正常组），异常74例（染色体异常组）。

纳入标准：处于非急性感染期，无明显凝血功能异常；宫内活胎；穿刺成功，标本量足够，羊水无混血；羊水培养成功；具有单一的羊水穿刺指征。

排除标准：无穿刺指征而孕妇本人要求行羊膜腔穿刺术；双胎或多胎妊娠；有高血压、糖尿病等原发内外科疾病；因多个穿刺指征行羊膜腔穿刺术的患者；羊水培养失败。

羊水穿刺指征：唐氏筛查高风险或临界风险；年龄≥35周岁；妊娠早期时接触过可能导致胎儿先天缺陷的物质；曾经分娩过先天性严重缺陷婴儿；超声提示胎儿结构异常；羊水过多或者过少；胎儿颈部透明层厚度值异常；夫妻一方患有先天性疾病或遗传性疾病，或有遗传病家族史［6］。

1.2 研究方法

1.2.1 标本获取：在B超引导下，避开胎儿及胎盘、脐带等胎儿附属组织，抽取羊水33 mL。取15 mL分装于离心管中，2 000 r/min 离心10 min。留取上清液5 mL，置于另一无菌管中，保存于-80 ℃深冻冰箱［7］。

1.2.2 检测方法：采用LC-MS/MS技术检测羊水氨基酸、酰基肉碱相关指标，检测仪器为液相色谱-串联质谱仪（型号：Dionex3000-ABI3200 QTRAP，美国SCIEX公司）。将羊水上清液从-80 ℃深冻冰箱中取出，4 ℃下解冻，取5 μL用于串联质谱检测。将羊水上清液经含酰基肉碱和氨基酸内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，质控标本采用美国疾控中心提供的标准滤纸片，利用已知内标的浓度计算出所测氨基酸及酰基肉碱浓度［8］。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，计量资料以表示，染色体正常组与异常组分类比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

25个氨基酸指标和39个酰基肉碱指标中，染色体细胞培养及核型分析结果正常组和异常组（包括21三体、18三体、染色体平衡易位等）比较，Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2这5项指标的组间差异有统计学意义（P＜0.05）。其余59项指标组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3 讨论

产前筛查有多种方法，包括生物化学、影像学、细胞遗传学及分子生物学方法，各检查方法间相辅相成，可综合评估胎儿在宫内的发育情况，从而对先天性胎儿缺陷提前进行预判，为胎儿的处置方案提供依据。传统的诊断方式通常为影像学结合实验室生化或遗传相关检查结果，影像学主要包括颈部透明层厚度检查、胎儿排畸超声、胎儿磁共振检查，实验室检查主要包括抽取孕妇的外周血进行生化检查，计算唐氏筛查结果，或者行无创产前DNA检测检查；也可以抽取孕妇的羊水行细胞学和遗传学检查。产前实验室检查结果可为产前筛查和诊断提供更多更有利的证据，结果之间相互印证，可提高诊断的准确率。

表1 染色体正常组与异常组氨基酸和肉碱测定含量的组间比较（，μmol/L）Tab.1 Comparison of amino acid and carnitine levels between normal and abnormal groups（，μmol/L）

表1 染色体正常组与异常组氨基酸和肉碱测定含量的组间比较（，μmol/L）Tab.1 Comparison of amino acid and carnitine levels between normal and abnormal groups（，μmol/L）

1）P＜0.05 vs negative result.The first 25 indexes are amino acids，and the rest are acylcarnitine.

常规产前羊水检测因羊水培养周期较长（≥7 d），且妊娠是个动态的过程，等待结果的过程中随时可能出现病情变化。而LC-MS/MS技术只需1～2 d即可获得结果，如发现羊水中的氨基酸和肉碱中某些指标在某些先天异常胎儿与正常胎儿间存在差异，便可对异常胎儿做出初步评估，从而快速地为临床处置提供辅证。LC-MS/MS技术检测行羊膜腔穿刺术孕妇的羊水上清液，从中筛选可能造成先天性疾病的异常指标，简单、易行、高效，能够为胎儿宫内状态评估提供更多的依据。

本研究结果显示，染色体检测结果正常组和异常组在Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2这5个指标间存在差异。因目前对羊水中氨基酸及酰基肉碱检测值与遗传代谢病的联系的研究较少，且无明确定论，因此，其预示的意义理论上可以参考已经在临床普遍应用的患儿足跟血标本中的氨基酸与酰基肉碱值。Gly/Phe可能与非酮性高甘氨酸血症相关，该病是一种罕见的常染色体隐性遗传病，通常在新生儿期即出现临床症状，存活者通常有严重的神经系统后遗症，如神经系统发育迟缓、严重的认知障碍、难治性癫痫等［9］。C4-OH和C16-OH异常分别可能与短链-3-羟基CoA脱氢酶缺乏症和长链-3-羟酰基CoA脱氢酶缺乏症相关，且它们都可能与三功能蛋白酶缺乏症发病相关。临床上可表现为肝病、肺病，或二者皆有，极少数患者可累及皮肤，出现脂膜炎、红色痛性皮肤结节或皮肤损害等，也可出现血管炎的表现［10］。C3/C2异常可能与甲基丙二酸血症，丙酸血症的发生相关，主要临床表现为患儿进食差、智力及运动发育落后，可合并营养不良、体质量不增、抽搐、呕吐、意识障碍、皮肤损害等［11］。而与C6：1异常相关的疾病目前尚未发现，仍需进一步探索［12］。

综上所述，应用LC-MS/MS技术早期筛查有高危妊娠倾向孕妇羊水中的Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2具有较高的应用价值，且该检测方法价格低廉，效率较高，还可以多靶点同时筛查。但LC-MS/MS本身并不能作为诊断遗传病的金标准，需要与其他检查协同应用，以提高诊断效能。找到胎儿染色体核型异常涉及的氨基酸或酰基肉碱的代谢指标以及代谢通路异常对于产前早期筛查、诊断有着重要的临床意义。