李儒佑,冯六连,柯正华,周 朕,黄永军,王钢胜

(鄂东医疗集团黄石市中心医院,湖北理工学院附属医院呼吸内科,黄石 435000;*通讯作者,E-mail:995491185@qq.com)

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是常见和多发的一种非特异性炎症性疾病,近年来发病率呈上升趋势[1],在给患者生活质量带来影响的同时,亦可导致哮喘、鼻窦炎等的发生和进展,从而进一步加剧了患者痛苦[2]。研究表明[3],免疫炎症反应在AR发病及进展中发挥重要作用。NOD样受体蛋白结构域3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体是由NLRP3、接头蛋白凋亡相关点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬酶1(Caspase-1)组成的、存在于细胞内的一种复合体,在促进炎症反应中发挥重要作用[4],有研究指出[5],NLRP3炎症小体活化参与了AR发病,且与炎症反应程度有关。基因重组干扰素作为由人体细胞分泌的蛋白,其中,γ干扰素(IFN-γ)是主要类型之一,在免疫调节及抗炎中发挥重要作用[6]。IFN-γ是否通过影响NLRP3炎症小体活化而参与AR发病,目前鲜有报道。本研究通过构建大鼠AR模型,并采用鼻腔滴入的方式给予IFN-γ干预,观察其对大鼠鼻黏膜中NLRP3炎症小体活化的影响,以期为AR临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组大鼠IFN-γ购自德国RELIATech公司,卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和氢氧化铝粉剂购自美国Sigma公司,Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司,逆转录和PCR扩增试剂购自日本TaKaRa公司,NLRP3、ASC、Caspase-1和内参序列由上海生工生物公司设计合成,兔抗大鼠NLRP3多克隆抗体购自美国Abcom公司,兔抗大鼠ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗体购自美国SantaCruz公司,鼠白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-8检测试剂盒购自上海恒远生化试剂有限公司,鼠OVA特异性IgE(OVA specific IgE,OVA-sIgE)检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠30只,SPF级,体质量240-280 g,8周龄,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证号:SCXK(沪)2017-0005),饲养于标准环境,自由饮水进食,适应性饲养7 d。利用随机数字表随机分为对照组、AR组和IFN-γ组,每组10只。

1.3 AR大鼠模型构建

参考文献[7]中的方法构建AR大鼠模型。基础致敏:制备含0.3 mg OVA和30 mg氢氧化铝粉剂的生理盐水1 ml,对AR组和IFN-γ组大鼠进行腹腔注射,隔日1次,注射7次,对照组大鼠则腹腔注射含30 mg氢氧化铝粉剂的生理盐水,用法用量同AR组和IFN-γ组。强化致敏:从第14天开始,AR组和IFN-γ组大鼠分别用含5% OVA的生理盐水滴鼻,双侧鼻腔各滴100 μl,1次/d,连续7 d。激发AR:强化致敏后,间隔7 d,用50 μl的1% OVA进行激发,连续20 d,均出现AR典型的症状和体征,如嗜睡、毛蓬松、活动减少、喷嚏不止并搔抓鼻部、出现鼻流液、觅食改变等,且随着激发次数增多而症状加重。对照组大鼠则以同样的方法给予等量的生理盐水。整个建模过程中各组大鼠均无死亡。AR组和IFN-γ组大鼠从激发第1天开始,在给予OVA激发前30 min,分别给予PBS和IFN-γ(浓度为0.02 μg/μl)滴鼻,50 μl/侧,1次/d。

1.4 AR大鼠模型评价

各组大鼠于末次激发后30 min内,对大鼠进行行为学评分[8]。流涕:1分,涕流至鼻前孔；2分,超过鼻前孔；3分,涕流到面部;喷嚏:1分,1-3个；2分,4-10个；3分,>10个;搔鼻:1分,轻轻擦鼻2次以内；2分,反复剧烈擦鼻不止。各项得分相加,>5分则提示模型构建成功。

1.5 标本采集

各组大鼠于评价结束后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,用无菌生理盐水对各组大鼠双侧鼻腔灌洗,收集灌洗液,4 ℃,3 500 r/min离心15 min,取上清,-80 ℃保存;处死各组大鼠,取血液2 ml,3 500 r/min离心10 min,-80 ℃保存;分离大鼠鼻骨前皮肤,去除鼻骨,取双侧鼻腔呼吸区黏膜,立刻置于液氮中,-70 ℃保存。

1.6 实时荧光定量PCR

取双侧鼻腔呼吸区黏膜组织,剪碎研磨,加入细胞裂解液,离心取上清,加入总RNA提取试剂,离心取沉淀,用紫外分光光度计检测RNA纯度,以A260/A280>1.80为合格。用逆转录试剂对RNA进行逆转录成cDNA,以cDNA为模板用PCR仪对引物扩增。引物序列:NLRP3:上游5′-CTGCATGCCGTATCTGGTTG-3′,下游5′-GCTGAGCAAGCTAAAGGCTTC-3′;ASC:上游5′-AGACATGGGCATACAGGAGC-3′,下游5′-GCAATGAGTGCTTGCCTGTG-3′;Caspase-1:上游5′-AAGAAGGTGGCGCATTTCCT-3′,下游5′-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3′;GAPDH:上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′,下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。反应条件:92 ℃ 3 min,92 ℃ 30 s,92 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,76 ℃ 30 s,共36个循环,每个样品设平行复孔6个,用2-ΔΔCt法计算大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量。

1.7 Western blot检测

取双侧鼻腔呼吸区黏膜组织,剪碎研磨,加入细胞裂解液,离心、提取总蛋白。BCA法检测浓度,取50 μg总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂奶粉封闭60 min,加入一抗兔抗大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗体(稀释比例为1 ∶800，1 ∶1 000，1 ∶500和1 ∶600),4 ℃过夜孵育，TBST冲洗3次，加入二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育120 min，TBST冲洗3次，暗室曝光20 min，拍照，用Image J图像分析软件分析对各条带灰度值分析。

1.8 酶联免疫吸附试验(ELISA法)

利用ELISA法检测大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE浓度,在标准条件下严格按照试剂盒说明完成操作。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 重组IFN-γ滴鼻对AR大鼠症状的影响

AR组和IFN-γ组大鼠在激发后均出现了AR症状,但IFN-γ组大鼠症状较AR组轻,对照组则仅有少数大鼠有抓挠鼻部的表现,未出现其他症状;末次激发后30 min内,对照组、AR组和IFN-γ组行为学评分分别为(0.80±0.79)分、(7.80±1.48)分和(5.50±0.71)分,差异有统计学意义(F=146.132,P<0.01),AR组大鼠行为学评分高于对照组,而IFN-γ组大鼠行为学评分低于AR组,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 重组IFN-γ对鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表达的影响

AR组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量均高于对照组,而IFN-γ组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量均低于AR组,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表达(n=10)

Table 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 mRNA in nasal mucosa of rats(n=10)

分组NLRP3 mRNAASC mRNACaspase-1 mRNA对照组1.03±0.141.00±0.061.02±0.07AR组1.86±0.17a1.63±0.14a1.72±0.10aIFN-γ组1.53±0.16ab1.38±0.15ab1.40±0.06ab F69.69366.736216.044 P<0.01<0.01<0.01

与对照组比较,aP<0.05;与AR组比较,bP<0.05

2.3 重组IFN-γ对鼻黏膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白表达的影响

AR组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相对表达量均高于对照组,而pro-Caspase-1蛋白相对表达量低于对照组,IFN-γ组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相对表达量均低于AR组,而pro-Caspase-1蛋白相对表达量高于AR组,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达(n=10)

Table 2 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats(n=10)

分组NLRP3ASCpro-Caspase-1Caspase-1 P20对照组0.25±0.030.19±0.020.68±0.090.18±0.07AR组0.75±0.06a0.79±0.05a0.28±0.050.67±0.07aIFN-γ组0.48±0.04ab0.41±0.05ab0.44±0.050.52±0.08ab F201.910235.18692.14966.428 P<0.01<0.01<0.01<0.01

与对照组比较,aP<0.05;与AR组比较,bP<0.05。

图1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达Figure 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats

2.4 重组IFN-γ对鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE的影响

AR组大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE浓度均高于对照组,而IFN-γ组大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6水平和IL-8及血清中OVA-sIgE浓度均低于AR组,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 各组大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE浓度(n=10,pg/ml)

Table 3 The levels of IL-1β, IL-6 and IL-8 in bilateral nasal lavage fluid and the concentration of OVA-sIgE in serum in each group(n=10,pg/ml)

分组IL-1βIL-6IL-8OVA-sIgE对照组33.17±5.6225.73±5.4433.34±6.49 21.52±5.04AR组85.52±6.73a67.89±6.81109.39±15.68a48.25±6.17aIFN-γ组57.16±7.72ab39.65±5.49 71.37±9.12ab35.64±4.28ab F151.094130.403116.900105.529 P<0.01<0.01<0.01<0.01

与对照组比较,aP<0.05;与AR组比较,bP<0.05

3 讨论

AR是由过敏原引起的IgE介导的多种炎症介质、细胞因子及免疫活性细胞参与的鼻黏膜慢性炎症,具有发病率高、对人群生活质量影响大的特点[9]。该病病因及发病机制较为复杂,在治疗时主要以抗组胺药及皮质类固醇等为一线治疗药,但这些药物均会带来不同程度的不良反应[10]。IFN-γ作为近年来用于免疫调节的药物,在改善免疫力及抑制炎症反应中发挥重要作用[11],重组IFN-γ是通过基因工程合成,其生物学活性与人体产生的完全一致[12],同时,该药无抗组胺药及皮质类固醇等的不良反应,已被用于肝纤维化[13]及自身免疫性疾病[14]的临床治疗。严孝花等[15]指出,重组人IFN-γ治疗变应性鼻炎可获得明显的近期疗效。本研究利用OVA对大鼠全身致敏及局部激发的方法制备AR模型,结果显示,AR组和IFN-γ组大鼠在激发后均出现了AR症状,如嗜睡、毛蓬松、活动减少、喷嚏不断并搔抓鼻部、出现鼻流液、觅食改变等,且随着激发次数增多而症状加重,且行为学评分均在5分以上,而对照组则仅有少数大鼠有抓挠鼻部的表现,说明成功构建了大鼠AR模型。同时,本研究结果显示,IFN-γ组大鼠在激发后AR症状较AR组轻,且末次激发后30 min内行为学评分低于AR组,说明IFN-γ滴鼻干预可有效减轻大鼠AR症状。

炎症小体是存在于细胞中的多蛋白复合物,在介导机体免疫应答、自发炎症及自身免疫性疾病发生、进展中发挥重要作用[16],NLRP3炎症小体是主要的炎症小体类型,由NLRP3蛋白、ASC和Caspase-1组成,一般情况下,NLRP3蛋白处于抑制状态,一旦受到外界刺激(如病原微生物、胞内代谢物等)时,NLRP3蛋白便会与配体结合发生结构改变,进而与ASC结合,通过ASC的CARD结构域招募并将Caspase-1激活,而Caspase-1活化则可对无活性的IL-1β、IL-18等前体进行加工活化,从而成为有活性的IL-1β和IL-8炎症因子,并促进其分泌至胞外发挥炎症级联反应[17],亦有研究指出[18],NLRP3炎症小体激活可促使IL-6分泌增加而促进炎症反应。IFN-γ可以通过活化诱导型一氧化碳合酶而加速胞内NO合成,而NO可通过诱导NLRP3亚硝基化而阻止炎症小体的组装[19]。本研究结果显示,AR组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量均高于对照组,AR组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相对表达量均高于对照组,而pro-Caspase-1蛋白相对表达量低于对照组,AR组大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE浓度均高于对照组,说明NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与了AR发病过程,同时,本研究结果显示,IFN-γ组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量均低于AR组,IFN-γ组大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相对表达量均低于AR组,而pro-Caspase-1蛋白相对表达量高于AR组,IFN-γ组大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE浓度均低于AR组,说明IFN-γ可能通过抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应而减轻AR大鼠症状。

综上所述,重组IFN-γ滴鼻对AR大鼠具有一定的治疗效果,可有效减轻AR大鼠症状,其机制可能与重组IFN-γ抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应有关,有望为AR临床应用提供实验支持。