王 方,席 爽,逯 宜

(1西安交通大学口腔医院,陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,西安 710004;2西安交通大学口腔医院口腔修复科;*通讯作者,E-mail:xjtuff@126.com)

龋坏、牙周炎、创伤等原因导致的牙列缺损或缺失会损害患者咀嚼功能及美观,并降低患者生活质量[1,2]。同其他组织工程一样,支架材料在牙本质再生过程中提供新组织生成的物理及生化支持[3,4]。组织工程材料对牙再生的意义非凡[5]。现有人造成牙相关支架材料缺乏成牙诱导因素,包括各种化学因子及材料表面微结构的诱导,导致很难再生出满足临床需求的牙本质组织。

牙本质中的生物活性物质是经成牙本质细胞分泌并储存在牙本质结构中,成牙本质细胞外的理化微环境对诱导牙源性细胞的牙再生能力具有重要意义。生物体自身的细胞外基质及所处的微环境对生物体的细胞行为具有重要的诱导作用。在牙组织工程中,牙本质基质富含成牙相关生物活性因子和适宜牙源性细胞生长的微结构,可以为多种牙源性细胞提供良好的成牙诱导微环境,促进牙源性细胞发挥功能[6]。大量的新鲜离体牙可为制备牙本质基质提供丰富的来源[7]。

如何有效保存和利用牙本质基质的生物活性物质和结构为牙组织工程提供理想的支架材料是牙组织工程的热点问题之一。有研究显示，乙二胺四乙酸(EDTA)表面脱矿处理能够使胶原纤维暴露并且可以改善牙本质的渗透性，增加牙本质生物活性物质的释放。经EDTA处理的牙体组织可释放成牙活性物质，营造良好的诱导微环境[8-10]。经过冷冻干燥处理的材料在密封处理后能在20 ℃左右或4 ℃长期储存。经冷冻干燥处理，材料可以维持冻干处理前的形态、构造及性质，方便储藏运输，具有广阔的前景。为了提高生物产品的长期稳定性，冷冻干燥同种异体牙本质粉作为骨再生材料已成功应用于牙周骨缺损患者的临床治疗[11]。

本研究探讨了冻干牙本质支架材料(FD)相关性能及其对牙髓干细胞(DPSCs)细胞活性及形态的影响,初步为牙本质基质支架材料的临床应用转化奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人未经处理的新鲜拔除牙(西安交通大学口腔医院);羟基磷灰石-磷酸三钙支架材料(HA,四川大学);胎牛血清;α-MEM培养液(Gibco,美国);谷氨酰胺(Gibco,美国);罗丹明-鬼笔环肽(Sigma,USA);DAPI(Sigma,美国);苏木精-伊红(Sigma,USA);Collagen type I ELISA kit(上海巧伊,中国);propidium iodide(PI)(Sigma,USA)。真空冷冻干燥机(Osterode/Harz,德国);酶标仪(BioTek,USA);激光共聚焦显微镜(Olympus,日本);Matlab软件(MathWorks,USA);EZTest/CE万能材料实验机(SHIMADZU,Japan)。

1.2 FD的制备

将人未经处理的新鲜拔除牙牙齿在-80 ℃中保存3个月以上，刮除牙周组织及牙髓组织后，将牙体组织置入超声清洗机中超声震荡清洗5 min，将清洁后的牙体组织表面采用EDTA梯度脱矿处理，-80 ℃预冻2 h，将预冻完成的牙体组织置于真空冷冻干燥机内，真空度0.06 mbar，冷井温度-54 ℃，置物仓-30 ℃的条件下，冷冻干燥72 h。辐照灭菌后可长期储存，用于后续力学及细胞学实验(见图1)。

A.新鲜拔除牙;B.冷冻干燥处理后牙体组织图1 新鲜拔除牙冷冻干燥处理前后对比图Figure 1 Tooth before and after low temperature storage and freeze drying treatment

1.3 挠曲强度检测

人牙本质组织体积较小,测量材料挠曲强度的通用配件无法用于测定小体积的人牙本质样本。为此,本研究特制了检测人牙本质的三点弯曲配件,用来检测牙本质的挠曲强度。该配件由上部配件及下部配件相对组成,上部配件为单个金属压头,下部配件为两个间隔5.5 mm的金属压头组成,上部压头位于两个下部压头的中央。下部压头的上端为弧形,在测量过程中可起到集中压力的作用(见图2)。测量前,将牙本质小柱垂直搭在两个下部配件压头上,放置时,尽量使两个压头外侧的牙本质小柱长度相等。测量时,上部配件以1 mm/min的速度缓缓下降,直至接触牙本质小柱,将挠度强度测试数据输入Matlab软件,并制作冻干牙本质(FD)、未处理牙本质(D)及羟基磷灰石-磷酸三钙(HA)三组的应力-应变曲线。

1.4 材料结构的组织学检测

对采用1.2方法制备的冻干牙本质生物活性材料(FD)和未冻干处理牙本质(D)两组材料进行组织学染色处理,对获得的组织学切片筛选各组材料不同角度的牙本质小管剖面的差异进一步观察。

图2 挠曲强度检测示意及定制配件(左下图)Figure 2 Flexural strength test and costumized fittings shown below left

1.5 胶原释放能力检测

采用ELISA法测定FD、未处理牙本质(D)、HA中Ⅰ型胶原(COL-1)的释放能力。将FD与未处理牙本质(D)置入液氮,经液氮冷却,材料的脆性增加,将研磨后获得的粉样材料等量分装,将HA粉末状按相同质量分装,三组粉末灭菌储存。每组材料按粉液(α-MEM培养液)比2 g ∶10 ml的比例配制,不加材料粉末的α-MEM培养液为对照组。将加入α-MEM培养液的FD组、D组、HA组和α-MEM组置入孵箱,分别在1,2,3,4,5,6,7 d取经过滤的上清液,按照ELISA检测说明书进行检测。采用ELISA法测定两个牙本质组及HA组材料的吸光度(450 nm波长),并绘制标准曲线,计算样本数值。

1.6 人牙髓干细胞(DPSCs)的获取及培养

用灭菌高速牙科手机沿牙体长轴的方向磨一道长沟,将灭菌小凿抵住长沟,用力凿开牙体组织,拔髓针拔髓,采用组织块法结合酶消化法将获得的牙髓细胞及组织置于含15% FBS的α-MEM中培养。

1.7 材料表面DPSCs细胞骨架形态检测

采用细胞骨架免疫荧光染色法检测各组材料(FD、D、HA、玻片)对实验细胞骨架形态的影响。DPSCs在四组材料表面培养17 h,进行固定,漂洗,Triton X-100破膜,PBS漂洗,1%BSA封闭1 h,PBS漂洗,37 ℃下phalloidin-rhodamine避光孵化1 h,PBS漂洗,DAPI复染5 min,PBS漂洗,封片后观察细胞骨架蛋白的特点。

1.8 不同材料对DPSCs细胞周期的影响

将DPSCs分别接种于FD、D、HA及玻片材料,分别置入含15% FBS的α-MEM培养液。培养3 d后,胰蛋白酶分别消化各组材料表面的DPSCs,经碘化丙啶染色,采用流式细胞仪分析材料表面DPSCs的细胞周期分布。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 挠曲强度检测结果

应力-应变曲线显示，D组的断裂应力略大于FD组，远大于HA组；在同一应变值下，D组加载应力高于FD组。D组挠曲强度为(194.1±24.3)MPa,FD组挠曲强度为(166.1±57.5)MPa,HA组挠曲强度为(6.2±0.2)MPa。弹性模量D组为(5.8±2.1)GPa,FD组为(4.7±1.5)GPa,HA组为(0.05±0.01)GPa。从挠曲强度实验结果可以看出,FD组的挠曲强度及弹性模量较D组略低,但差异无统计学意义,而HA组显著低于其他两组,且差异有统计学意义(P<0.01,见图3)。

FD:冻干牙本质;D:未处理牙本质;HA:羟基磷灰石-磷酸三钙;与HA组比较,**P<0.01图3 三组材料的力学性能检测Figure 3 Mechanical properties testing of materials in three groups

2.2 处理前后不同剖面牙体组织学检测结果

不同角度方向的FD组与未处理牙本质组(D组)材料的HE染色结果显示,FD组与D组牙本质小管结构清晰,冻干处理未明显改变牙本质小管的组织结构(见图4)。

图4 FD与D组牙本质小管的HE染色结果Figure 4 HE staining results of FD and D

2.3 胶原释放能力检测结果

两个牙本质组液体能通过ELISA法检测出COL1的存在,而HA组和α-MEM组均无Ⅰ型胶原检出。COL1在各牙本质组的含量除第5天两组具有统计学差异,其余时间冷冻干燥处理对牙本质的胶原释放能力差异无统计学意义(见图5)。

与D组比较，*P<0.05图5 两个牙本质组的Ⅰ型胶原检测吸光度值Figure 5 Type Ⅰ collagen detection values in two dentin groups

2.4 细胞周期检测结果

流式细胞术测定FD、D、HA及玻片表面DPSCs的细胞周期分布特点为:S+G2/M相的细胞百分比最低组和最高组分别为HA组α-MEM组,两个牙本质组S+G2/M相的细胞百分比相似,差异无统计学意义(见图6)。

2.5 各组材料表面DPSCs的肌动蛋白荧光检测结果

细胞肌动蛋白荧光强度和结构可反应细胞骨架的张力、范围及细胞和支架材料的关系。两个牙本质组肌动蛋白荧光粗大清晰、密集,且DPSCs间的肌动蛋白荧光可见重叠区域;而HA组及玻片组的牙髓干细胞肌动蛋白荧光不清晰,强度较弱,细胞间的交通也较欠缺(见图7)。

3 讨论

牙本质具有合适的机械性能并含有丰富的成牙相关活性物质,是一种适合牙再生的组织工程生物支架材料。有明确证据显示脱矿牙本质材料可用于牙再生[12]。然而牙本质生物材料保存方法的不足阻碍了这些研究成果的临床转化。冷冻干燥能够延长生物制品储存的长期稳定性,保存材料原本的理化性能并具有降低免疫原性的作用,结合可接受的处理费用使得冷冻干燥技术能够用于牙本质基质生物材料的制备中。实验结果显示,本研究制备的FD具有与未处理牙本质类似的理化性能,且对DPSCs的细胞活性及骨架蛋白结构具有积极作用。

牙本质的力学性能优越,能够在一定程度上抵御和降低牙合力对牙齿的冲击。许多牙科充填材料及全瓷材料的研制均希望达到牙本质相似的力学性能。许多细胞支架材料的开发也着重于与牙本质组织有相似的性能。

图6 FD、D、HA及α-MEM组DPSCs各相细胞分布图Figure 6 Cell distribution of DPSCs in FD, D, HA and α-MEM groups

图7 冻干牙本质活性生物材料(FD),未冻干牙本质(D),羟基磷灰石/磷酸三钙(HA),盖玻片(coverslip)对牙髓干细胞肌动蛋白免疫荧光强度及结构的影响 (scale bar=100 μm)Figure 7 Effects of freeze-dried dentin bioactive materials(FD), dentin(D), hydroxyapatite/tricalcium phosphate(HA) and coverslip on the immunofluorescence intensity and structure of actin in dental pulp stem cells (scale bar=100 μm)

骨与牙本质是人体内的主要硬组织,二者在细胞组成、组织结构、功能行使、组织来源上差异显著。本研究中用于制备冻干牙本质的流程在冻干骨制备流程上经过改良,制备而成的冻干牙本质具有良好的挠曲强度及弹性模量,这对细胞层面的组织再生及宏观层面的牙齿功能行使均有积极的作用。

材料的力学性能、构成、化学成分、与细胞接触部分的结构特征等等因素均会影响细胞与材料的初步接触、黏附及在材料表面及内部的生长[13]。本研究中各组材料与DPSCs相互作用的体外研究显示:FD组与D组表面DPSCs细胞骨架结构更为清晰,骨架蛋白荧光强度高,细胞间交通明显,表明牙本质的表面形态及储藏的多种成牙相关蛋白能够促进牙髓干细胞的生物学行为。细胞表面及内部存在大量感受外部环境的相关结构,细胞能够根据捕获的信息对材料做出进一步反应,即地形学(topographies)[14]。类似地,动力传导(mechanotransduction)理论认为,生物体细胞所处环境中众多因素,如材料结构、细胞受力情况等可经细胞内在处理后转变为内在的化学信息,这些化学信息将进一步影响细胞的增殖、分化及黏附等相关功能[15]。DPSCs在不同支架材料表面的长期生长分化模式可能与细胞和不同材料最初的接触模式有关。有研究显示牙髓干细胞-材料第一阶段的相互作用(包括细胞接触、黏附、伸展)会影响第二阶段DPSCs向成牙本质细胞的分化[16]。

支架材料的结构及形态会影响接种或归巢于其表面及内部的细胞行为。细胞外微环境同样会对细胞次级结构产生作用,如细胞黏附分子受体、构成成分、迁移轨迹、超细胞特征等，即材料对细胞的“接触诱导”。关于细胞与不同表面及内部结构的材料研究已相对深入,并建立多个有关“接触诱导”的理论[17]。

例如研究将硅胶材料处理成具有小管状的结构,在其上接种牙源性细胞,同时将牙源性细胞接种于光滑的硅胶材料表面,两组细胞显示出截然不同的胶原分泌能力及生物学行为:小管状硅胶表面的牙源性细胞能够进入小管,与生理情况更为相似[18]。

本研究挠曲强度检测结果表明,结合EDTA脱矿处理的冷冻干燥牙本质基质制备技术能够保持与天然牙本质相似的机械性能;组织学染色结果表明冻干处理前后牙本质的组织学结构未发生明显改变;而良好的机械力学性能和适宜DPSCs生长的微结构均有利于提高组织工程牙再生的成功率。COL1释放检测结果及冷冻干燥原理提示FD保留了牙本质中的生物活性物质,而细胞在冻干前后两组牙本质支架表面及在HA和玻片表面骨架蛋白形态的反差印证了材料结构和生物活性物质的保留对细胞产生的巨大影响。本研究研制的牙本质生物活性材料为组织工程牙再生提供具有应用前景的新型支架。另一方面,冻干技术使材料便于保存和运输,为组织工程牙库的建立提供支持,其制备成本使牙库的日常商业应用成为可能,为牙组织工程的临床转化提供依据。