董 宁,张田田,郭青玉,阮建平*

(1陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,西安交通大学口腔医学院儿童口腔科,西安 710004;2西安交通大学口腔医学院口腔预防科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:ruanjp@xjtu.edu.cn)

牙体硬组织无法自我再生和重建,而牙髓组织具有一定的修复和再生潜能[1],调控牙髓细胞的增殖分化从而形成修复性牙本质对于发展新的牙髓再生治疗方法有着重要的意义。然而,牙齿发育过程以及组织损伤后牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)的应答和修复是一个复杂的生物学过程,涉及到多种生物学过程,包括基因水平、分子水平和细胞水平的各种变化和相互调控,以及多种生物分子的参与,具体的作用机制尚不明确[2]。

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白,也是一种调控机体发育时相的异时性基因[3],Lin28可稳定表达于胚胎组织和一些具备强大修复再生能力的组织中,包括心脏和骨骼肌等[4]。研究证实过表达Lin28可以使得转基因小鼠的毛发、软骨、皮肤以及其他软组织在损伤后得到快速再生[5]。本课题组前期研究通过建立动物模型,证实了Lin28参与了牙髓牙本质复合体的损伤修复过程[6]。本研究通过调控Lin28基因在人牙髓细胞中过表达,观察其对牙髓细胞增殖、分化、矿化能力的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

1.2 人牙髓细胞(HDPCs)的分离培养及诱导分化

从西安交通大学口腔医院颌面外科门诊收集12-22岁志愿者(知情同意)因正畸减数或阻生新鲜拔除的健康完整恒牙,无菌条件下取出牙髓,放入PBS中;将牙髓剪碎,采用酶消化法收集细胞消化,并用20%胎牛血清的DMEM重悬后,接种于35 mm培养皿,放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中进行原代培养,待细胞融合率达80%后传代培养,取生长良好的第3代细胞用于后续实验。

用含10%的胎牛血清,抗生素,50 ng/ml维生素C,10 mmol/ml β-甘油磷酸钠和4 ng/ml地塞米松的DMEM作为矿化诱导培养基。随机将HDPCs分成3个组:未经转染的HDPCs(正常组);转染空载体的HDPCs(NT组);过表达慢病毒转染的HDPCs(Lin28组)。培养至待测时间时,分别进行细胞增殖、分化和相关基因的检测。

1.3 Lin28慢病毒转染

采用慢病毒包装系统构建携带目的基因Lin28和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的慢病毒载体LV-Lin28-EGFP,荧光倒置显微镜下筛选最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)为200转染DPCs。将细胞接种在6孔板上进行转染,培养至24 h加入不同浓度梯度的嘌呤霉素进行致死浓度实验,选择能使细胞全部死亡的最低浓度作为嘌呤霉素的最佳筛选浓度,经预实验确定0.5 ng/ml作为嘌呤霉素最佳筛选浓度。维持嘌呤霉素浓度,隔天换液,观察。连续4 d,至正常细胞全部死亡后,认为已经获得稳筛株。稳筛株细胞分别在培养72 h和96 h时收集,用于RT-PCR、Western blot检测Lin28转染结果。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖活性

取第3代HDPCs,按前述分组以5×103个/孔的细胞密度等量接种于96孔培养板,分别培养1,3,5,7 d,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。按说明操作后,酶标仪450 nm波长下测定各孔的吸光度值。实验重复3次后进行统计学分析,以只含有培养基和CCK-8试剂的孔作为空白对照。

1.5 生物化学发光法检测细胞三磷酸腺苷(ATP)水平

细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板,并设置空培养基孔作为对照,待细胞铺满率达到80%时加入裂解液冰上裂解细胞,低温离心后取蛋白上清,依据ATP检测试剂盒产品说明在检测孔中加入相应的工作液、标准品及Lin28过表达组及空白对照组样品,静置2 s,用酶标仪进行检测。根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度,换算成nmol/mg蛋白的形式进行统计学分析。

1.6 碱性磷酸酶(ALP)活性测定

各组细胞分别培养至7,14 d时加入细胞裂解液,使用碱性磷酸酶活性测定试剂盒检测ALP活性。加入工作液,37 ℃孵育10 min。终止反应后,用酶标仪在405 nm测定吸光度。ALP(U/mg)活性定义为1 mol对硝基苯酚每毫克细胞总蛋白的释放量。

1.7 茜素红染色观察钙化结节形成

上述实验分组细胞,加入成骨诱导培养液分别矿化诱导培养14,21 d,用茜素红染色观察矿化结节的形成情况。细胞清洗3次,固定液固定30 min,加入适量无菌茜素红,37 ℃温育30 min,吸掉茜素红用清洗液清洗3次,观察并拍照。

然而，近年来国产陶瓷在国际市场上一直保持着数量上（我国日用陶瓷总产量约占世界总产量的65%～70%）的大国地位，但从总体水平上看是大而不强（出口日用陶瓷平均单件换汇仅为0.21 美元，远远低于世界平均单件出口价格1 美元以上的水平，为英国、日本的 1/7，法国的 1/3），与国际先进水平相比还有较大的差距。随着我国物质生活和文化生活的不断发展提高，人们对高档有品质的日用陶瓷产品的需求也大大地提高了，这无疑给我过日用陶瓷产品发展带来了新的发展空间和契机，同时也对我国日用陶瓷产品设计提出了新的挑战和更新更高的要求。

1.8 qRT-PCR检测牙本质形成相关基因mRNA表达

检测过表达慢病毒转染人牙髓细胞后Lin28 mRNA的表达情况。同时上述三组细胞矿化诱导1,7,14 d,观察各组细胞中牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA表达情况。按试剂盒操作说明提取总RNA,逆转录成cDNA,再进行荧光定量PCR检测。使用的引物序列见表1。以ACTB表达水平作为内参,通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化进行定量分析。

表1 引物序列表

Table 1 Sequences of primers

基因序列(5′-3′) 长度(bp)Lin28正向:TATTGGGAGTGAGAGGCGGC21反向:TTGCATTCCTTGGCATGATGAT21DSPP正向:CCAGGGACAAGTAAGCATCA20反向:GACAACAGCGACATCCTCATT21OCN正向:CACACTCCTCGCCCTATTG19反向:CGCCTGGGTCTCTTCACTAC20OPN正向:GCCGTGGGAAGGACAGTTAT20反向:GCTCATTGCTCTCATCATTGG21DMP-1正向:AAGAGGTGGTGAGTGAGTCCA21反向:TTGAGTGGGAGAGTGTGTGC20ALP正向:TACAACACCAATGCCCAGGT20反向:ACAGATTTCCCAGCGTCCTT20ACTB正向:CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAGC23反向:CCAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG22

1.9 Western blot检测Lin28蛋白表达

Western blot实验检测过表达的Lin28蛋白表达情况。使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)测定蛋白浓度。蛋白分离然后转移到硝酸纤维膜上(Millipore,美国)。封闭后,用鼠抗人一抗Lin28(1 ∶1 000,Abcam,美国)孵育。洗涤后,用羊抗鼠IgG(1 ∶5 000,全式金,中国)孵育。最后洗涤,化学发光检测后使用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 HDPCs中Lin28的稳定过表达

分别用qRT-PCR和Western blot检测转染72 h和96 h的细胞样本,结果显示,与空白对照组和空载体组相比,过表达组Lin28 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05,见图1)。

2.2 Lin28过表达对HDPCs增殖活性的影响

CCK-8法增殖活性检测结果显示,三组的OD值随着时间变化均呈现上升趋势,检测第1天未见明显差异;而自第3天起,Lin28过表达牙髓细胞组的OD值明显高于正常牙髓细胞组和空载体转染组,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。空载体组和正常牙髓细胞组间的差异没有明显的统计学意义(P>0.05)。

与正常组和空载体组相比,*P<0.05图1 慢病毒转染HDPCs后Lin28的表达情况Figure 1 Expression of Lin28 in HDPCs after transfected by lentivirus

与正常组和空载体组相比,*P<0.05图2 Lin28过表达对细胞增殖活性影响Figure 2 Effect of Lin28 overexpression on cell proliferation

2.3 Lin28过表达对HDPCs ATP活性的影响

三组细胞接种培养72 h,收集进行ATP水平的检测,化学发光后酶标仪检测得出ATP浓度,结果见图3。统计分析结果表明,与空白组和空载体组比较,转染组细胞ATP水平较高(P<0.05),空载体组ATP水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 Lin28过表达对HDPCs碱性磷酸酶活性的影响

对三组细胞进行矿化诱导,分别在7,14 d行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,结果显示,Lin28过表达牙髓细胞各时间段ALP活性均较空载体转染牙髓细胞组和正常牙髓细胞组明显升高(P<0.05);而空载体转染牙髓细胞组和正常牙髓细胞组的ALP活性差异没有统计学意义(P>0.05,见图4)。

A.ATP标准曲线 B.细胞ATP水平测定结果图3 Lin28过表达对细胞ATP水平影响Figure 3 Effect of Lin28 overexpression on ATP level

与正常组和空载体组相比,*P<0.05图4 Lin28过表达对细胞碱性磷酸酶(ALP)活性影响Figure 4 Effect of Lin28 overexpression on ALP activity

2.5 Lin28过表达对HDPCs钙化结节形成的影响

分别在14 d和21 d用茜素红染色观察各组矿化结节的形成情况,结果显示:三组均形成不同程度的桔红色矿化结节,14 d和21 d时,Lin28慢病毒转染组牙髓细胞形成的矿化结节数远远超出空载体组和正常组,而空载体转染组和正常牙髓细胞之间的矿化结节形成程度无明显差别(见图5)。

图5 Lin28过表达对HDPCs钙化结节形成的影响(茜素红染色)Figure 5 Effect of Lin28 overexpression on calcified nodules in HDPCs by Alizarin red staining

2.6 Lin28过表达对牙本质形成相关基因表达的影响

稳定表达Lin28后,人牙髓细胞成骨相关基因表达均较正常组和空载体组呈现上升趋势。其中,DSPP、DMP-1、OCN、OPN mRNA的表达量均较转染空载体牙髓细胞和正常牙髓细胞表达上调(P<0.05),14 d时过表达组较正常组和空载体组表达量的差异最为明显,而转染空载体的牙髓细胞与未转染牙髓细胞相比各成骨相关基因的表达均无统计学意义(P>0.05,见图6)。Lin28过表达组ALP mRNA在1 d时的表达与转染空载体的牙髓细胞组和未转染牙髓细胞组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但在7 d和14 d时呈明显增高趋势,与正常组和空载体组差异具有统计学意义(P<0.05,见图6)。

与正常组和空载体组相比,*P<0.05;与正常组比较，#P<0.05图6 Lin28过表达对成牙本质相关基因的mRNA相对表达水平的影响Figure 6 Effect of Lin28 overexpression on expression of odontoblast-related genes

3 讨论

牙髓细胞修复再生的研究长期以来备受学者关注,牙髓细胞中的间充质干细胞被证实有较强的克隆增殖能力和多向分化潜能[7,8]。牙髓细胞在体外矿化诱导下,具有向成牙本质细胞样细胞分化的能力。这些能力使牙髓细胞不仅用于研究牙齿再生,也是骨组织等多重器官再生研究的重要模式细胞之一[9],而与之密切关联的基因也被陆续发掘出来,其中多数具有调控作用的因子属于干细胞调控因子和信号通路分子[10,11]。

Lin28被证实能增强多种细胞的增殖活性,并能让胚胎干细胞维持多能性。在线虫中过表达Lin28发现幼虫的青春期被延长,延缓了成熟时间。近年来国内外多项涉及转基因小鼠模型及体外肌肉、神经等各种组织细胞的实验研究,均证实了适度提升Lin28的表达水平会有效提高细胞的增殖活性和器官的代谢水平,有利于组织修复再生[12,13]。这些特点赋予了Lin28“青春基因”的美誉[14]。正常情况下,Lin28高表达于胚胎组织细胞,随着器官发育和细胞分化，其表达逐渐沉默,不再具备明显的调控功能。此外,Lin28亦被认为是一种“致癌基因”,包括畸胎瘤和生殖、消化系统肿瘤在内的癌细胞中均发现了Lin28的异常高表达[15,16]。因此如何控制Lin28的表达含量而不至于引起组织和细胞恶性增殖也关系到Lin28的功能性应用。研究显示[5],“再唤醒”生命体内的Lin28适度过表达可以促进细胞代谢水平,加速小鼠表皮和软骨的损伤修复过程。而联合转导包括Lin28在内的各种“干性”基因,能够重组体细胞,重新赋予体细胞“多能性”[17]。这提示我们通过诱导激活或者外源性转导等方法提高Lin28的持续表达水平,可能会改变牙髓组织和细胞的修复再生能力。

动物实验已证实Lin28参与了牙胚正常发育[18]及牙髓牙本质复合体损伤修复过程[6],在此基础上,本研究通过体外细胞实验观察了Lin28过表达后对牙髓细胞的影响。我们利用慢病毒载体转染,使得牙髓细胞稳定、持续、高效表达Lin28基因。随后通过增殖、细胞能量、分化、矿化相关实验结果显示,稳定过表达Lin28的牙髓细胞增殖水平明显高于正常牙髓细胞,证明了Lin28同样具备促进牙髓细胞增殖活性的能力。有研究发现牙髓组织内压力增大时,牙髓细胞会释放三磷酸腺苷(ATP),从而增强细胞活性并调节干细胞的分化[19]。本实验发现过表达Lin28能提高牙髓细胞的ATP活性,提示我们调控细胞能量和氧化磷酸化可能是Lin28的主要功能之一。同时,经矿化诱导培养后Lin28过表达的牙髓细胞中碱性磷酸酶(ALP)的水平均高于其他组,说明Lin28对牙髓细胞的分化也有促进作用。此外,过表达Lin28组在诱导培养14 d和21 d的矿化结节形成的数量和范围都显著高于其他组,实验证明,稳定表达Lin28可以促进牙髓细胞的成牙能力,并促进了牙本质基质的形成。

牙髓细胞的修复再生能力是通过一系列交互反应实现的,包括增殖、趋化和向成牙本质细胞的分化,从而促使修复性牙本质形成[2]。因此牙髓组织中已分化和未分化的细胞均会参与到牙本质再生过程中[20]。而成牙本质细胞会分泌许多胶原蛋白和非胶原蛋白,包括骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein-1,DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)等。这些分子都是衡量牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化的矿化标记物[21]。本研究中,人牙髓细胞稳定表达Lin28后,矿化相关基因mRNA相对表达水平均明显上升。说明Lin28可能通过调控人牙髓细胞相关基因表达来影响成牙本质细胞样细胞的分化和矿化基质的合成。

本研究通过一系列细胞表型研究,证实了Lin28对于牙髓细胞的正向调控作用,实验证明Lin28能够提升人牙髓细胞的活性及能量代谢水平,从而可能有利于牙髓组织的修复和再生。但是具体的调控方式仍有待于深入研究验证,同时需要各项体内体外实验揭示Lin28在牙髓组织中的亚细胞定位变化及基因结合位点,以观察证实Lin28在牙髓损伤修复过程中细胞迁移方向和参与程度。