李红霞,李瑞娇,张汝月,张引红,郭兴萍*

(1山西省生殖科学研究所,出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室,太原 030006;2山西医科大学实验动物中心;*通讯作者,E-mail:sxxp555@163.com)

人子宫内膜是一个高度再生的组织,女性一生大约要经历子宫内膜400多个周期的脱落和再生。研究发现,子宫内膜这种巨大的再生能力被认为与人类子宫内膜干细胞有直接关系[1],受到越来越多学者的关注。目前,子宫内膜干细胞分类较为多样化,包括子宫内膜细胞侧群(side population, SP)、子宫内膜间充质干细胞、月经血来源的干细胞等[2],其中子宫内膜间充质干细胞因其数量较多,生物学特性明显等受到更多关注[3]。但其取材的特殊性对该研究的多样化和深入程度造成了一定的影响。

小鼠虽然不具备灵长类动物的月经周期,但也具有规律的动情周期,并且其动情周期伴随着子宫内膜细胞的增生及衰亡[4]。另外,Chan等[5]通过标记滞留技术检测发现,小鼠子宫中也含有子宫内膜干细胞。参考这种情况,本实验获取小鼠子宫组织,分离培养得到小鼠子宫内膜间充质干细胞,并对该细胞进行鉴定,为薄型子宫内膜小鼠的内膜修复提供材料,也为治疗人薄型子宫内膜及子宫内膜受损的相关疾病提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 小鼠子宫组织

小鼠子宫组织来源于C57BL/6J经产离乳小鼠(生了小鼠,小鼠离乳后的母鼠),SPF级,购自山西医科大学实验动物中心(SCXK(晋)2015-0001)

1.2 主要试剂

细胞培养液MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)、L-Glutamine购自STEMCELL Technologies(Canadian)公司，胶原酶Ⅲ、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、青链霉素混合液(100×)、台盼蓝染色液(0.4%)、CCK-8试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，CELLSAVING无血清细胞冻存液购自苏州新赛美生物科技有限公司。流式抗体(CD29-APC/CD45-PerCP-Cy5.5/CD73-PE-Cy7/CD105-APC/CD117-APC)购自eBioscience公司(USA)。

1.3 小鼠子宫内膜间充质干细胞分离

脱颈处死小鼠,75%酒精消毒,取双侧子宫,置于1×PBS中清洗,剪去系膜等。在PBS中将子宫剪成1 mm×1 mm左右块状,将小块转移至1.5 ml EP管,加入酶混合液(0.1%胶原酶+0.08%胰酶),37 ℃水浴45 min,加入含10% FBS的培养液中止消化,将消化后所有的液体吸取至15 ml离心管,培养箱放置待用。管中沉淀再次加入酶混合液，37 ℃恒温水浴45 min，加入含10% FBS的培养液中止消化，两次消化所得液体混合，用70 μm细胞过滤器过滤液体。将过滤后的液体1 000 r/min离心10 min。弃上清，加培养液重悬，再次离心。所得沉淀即为子宫内膜细胞，取培养液重悬计数后即可进行培养。

1.4 小鼠子宫内膜间充质干细胞培养

将细胞计数,置于25 ml培养瓶中放入培养箱,培养环境为37 ℃,5% CO2,10% O2,85% N2。培养第7天,镜下观察若细胞80%-90%融合,则进行1 ∶2或者1 ∶3传代,若细胞融合过低,则进行半量换液,第10天镜下观察传代。传代时,PBS冲洗3次,冲去残留的培养液,用2.5%胰蛋白酶消化3 min,加入含10% FBS培养液中止消化,反复吹打瓶壁,将所获单细胞悬液1 000 r/min,离心10 min。弃上清,完全培养液重悬细胞,计数后培养。

1.5 小鼠子宫内膜间充质干细胞生长曲线测定

取生长状态良好的第3代细胞(P3)和第5代细胞(P5),分别于对数期消化后细胞培养液重悬,制成2×104/ml细胞悬液。参照CCK-8说明书,将细胞接种在96孔板,每孔100 μl,加样孔数为7×9孔。96孔板的周边孔分别加入细胞培养液100 μl,以保持环境湿润(CCK8加样示意图见图1)。37 ℃培养24 h，培养条件为5% CO2、10% O2、85% N2。细胞培养1，2，3，4，5，6，7 d,每天设7个复孔，2个空白对照孔。测定前实验孔每孔加入10 μl CCK-8，孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长吸光度值。

图1 CCK-8加样示意图Figure 1 CCK-8 sketch map of loading

1.6 小鼠子宫内膜间充质干细胞表面标志物表达

流式细胞仪鉴定小鼠子宫内膜间充质干细胞表面标记,取生长状态良好的小鼠子宫内膜干细胞P3和P5,消化后用PBS重悬,制成1×108/ml单细胞悬液,取流式管,每管加入100 μl细胞悬液,共6管。第1管为空白对照,剩余5管参考说明书分别加入流式抗体(CD29-APC-0.625 μl/CD45-PerCP-Cy5.5-0.3 μl/CD73-PE-Cy7-0.625 μl/CD105-APC-0.625 μl/CD117-APC-0.625 μl),混匀,4 ℃孵育30 min，上机检测。

1.7 小鼠子宫内膜间充质干细胞的冻存

小鼠子宫内膜间充质干细胞冻存采用新赛美无血清细胞冻存液。冻存步骤如下:常规方法收集对数期的贴壁细胞置于离心管中,1 000 r/min离心5 min,弃上清,收集沉淀,根据细胞数加入新赛美无血清细胞冻存液,调整细胞终浓度为5×105-1×107/ml。轻柔地混匀细胞,制成细胞混合液,分装于冻存管,每管1 ml。-80 ℃保存。

1.8 小鼠子宫内膜间充质干细胞复苏

从冰箱中取出冻存的细胞，立即放入37 ℃水浴锅中快速解冻。待冻存管中细胞混合液完全融化后，立即加入1 ml细胞培养基于冷冻管中与细胞混合。将混合液转移至含有约5 ml细胞培养基的离心管中，混匀，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，收集沉淀。加入适量的新鲜细胞培养基，轻柔混匀，取0.1 ml细胞悬液与0.4%台盼蓝染色液0.9 ml混匀，3 min内用细胞计数板计数死细胞与活细胞，其中死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)。

细胞计数后，将重悬的干细胞悬液1.9 ml平均分装转入2个25 ml培养瓶中，添加培养液至5 ml，37 ℃，5% CO2、10% O2、85% N2培养。

2 结果

2.1 小鼠子宫内膜间充质干细胞形态学观察

原代分离培养的子宫内膜干细胞24 h置于倒置显微镜下观察,1 d可见细胞基本贴壁,少量梭形细胞和多角形细胞,多为圆形细胞。随着时间延长,3-4 d,大多为梭形细胞,到6-7 d,可见不同大小的集落,呈漩涡状。继续观察,若7 d左右融合率过低,半量换液后继续培养,大约10 d达到80%-90%融合,可见细胞排列成网状。原代含有部分错落的圆形细胞(小鼠子宫内膜间充质干细胞分离培养,见图2)。

A.培养1 d;B.培养3 d;C.培养7 d;D.培养10 d图2 小鼠子宫内膜间充质干细胞分离培养 (×100)Figure 2 Culture of mesenchymal stem cell from mice endometrium (×100)

2.2 小鼠子宫内膜间充质干细胞的生长与传代

随着传代次数的增多,圆形细胞逐渐消失,细胞形态越来越统一,传代细胞较扁平,呈极性排列。各代间细胞形态基本无变化(见图3)。

2.3 小鼠子宫内膜间充质干细胞增殖曲线

以时间(天数)为横轴，OD值为纵轴，绘制小鼠子宫内膜干细胞增殖曲线。小鼠子宫内膜间充质干细胞生长曲线，传代培养潜伏期为1-3 d，增长较为缓慢。对数期为4-6 d，细胞进入快速增长阶段。对数期后增长速度逐渐下降。P3和P5两代细胞增殖曲线无明显区别(见图4)。

2.4 小鼠子宫内膜间充质干细胞表面标志物表达

对P3，P5小鼠子宫内膜间充质干细胞进行流式细胞术检测，小鼠子宫内膜间充质干细胞表面标记物流式细胞仪检测结果见图5。结果发现P3细胞尚未达到比较理想的纯化状态，P5细胞纯化效果较好。小鼠子宫内膜干细胞第5代高表达CD29(97.7%)，CD73(85.2%)，CD105(99.8%)，低表达CD45(5.6%)，不表达CD117(0.1%)。

A. 第3代细胞 B.第5代细胞图3 小鼠子宫内膜间充质干细胞传代培养 (×100)Figure 3 Observation of mesenchymal stem cells from mice endometrium after different passages (×100)

图4 小鼠子宫内膜间充质干细胞增殖曲线Figure 4 Proliferation curve of mesenchymal stem cell from mice endometrium

2.5 小鼠子宫内膜间充质干细胞的冻存与复苏

台盼蓝法计数(细胞计数板),细胞复苏后存活率达到96%以上,生长状态良好,增殖能力强,与冻存前细胞活力无明显差异。

图5 P5流式细胞仪分析小鼠子宫内膜间充质干细胞表面标记物Figure 5 Phenotypic analysis of mesenchymal stem cell from mouse endometrium by flow cytometry

3 讨论

1978年,Prianishnikov[6]首次提出子宫内膜干细胞这一概念,人类开始意识到,具有强大再生能力的子宫内膜干细胞在子宫内膜周期性的增生和剥落中扮演着不可忽视的重要角色。2004年,Chan等[7]首次从女性子宫内膜组织中分离出人子宫内膜基质细胞和上皮细胞,并通过单克隆细胞培养、相关干细胞因子的表达等证明子宫内膜中确实存在子宫内膜干细胞。2009年,Gargett等[8]通过再次确定人子宫内膜干细胞巨大的再生能力及体外诱导分化等实验,确认子宫内膜干细胞不仅在子宫内膜再生干预方面有重大作用,也因其易于获得,从而为基于间充质干细胞的细胞疗法提供了一种新的可能。近年来,经血源性干细胞逐渐走入大众视野,不仅取材方便,获得过程对供体无手术风险,更因其比分泌期子宫内膜干细胞具有更强的增殖能力和自我更新能力得到了行业的广泛关注[9]。将源于经血的干细胞作为细胞治疗的种子细胞移植所进行的修复研究也已涉及心肌梗死、Duchenne型肌营养不良、Ⅰ型糖尿病、结肠炎及子宫内膜修复等多个方向及领域[10-12]。

由于伦理学、有创采集等多种原因,人体作为子宫内膜干细胞的供体,深入研究有诸多不便。小鼠作为应用最多的实验动物,有着众多不可忽视的优势。虽然月经是人和灵长类动物特有的生殖特性,小鼠属于啮齿类动物,不具备这一特性。但是小鼠具有和人类相似的子宫结构和规律的动情周期。小鼠的动情周期为4-5 d,每个动情周期都伴随着子宫细胞的增生和凋亡[4]。同时2006年Chan等[5]已通过标记滞留细胞(label retaining cells,LRCs)首次确定C57BL/6J小鼠子宫中含有子宫内膜干细胞。胡菲菲等[13]从生育期小鼠4个动情期(动情前期、动情期、动情后期、动情间期)和小鼠产后子宫内分离子宫内膜干细胞,并比较这些子宫内膜干细胞数量,结果发现产后小鼠子宫中SP细胞明显多于正常未孕的小鼠。徐静[14]通过Hoechst-SP法检测小鼠产后第1,3,7,14,17.5,21,28,60天子宫内膜SP细胞比率,发现第17.5天时的SP细胞比率达到峰值。新生小鼠约21 d离乳,考虑到动物福利的情况,综合考虑,本实验最终选择产后21-23 d的C57BL/6J母鼠作为实验材料,获取子宫内膜干细胞。

子宫内膜分离消化的方法主要包括机械研磨法、剪碎法、酶消化法、组合法等多种方法[14,15],其中剪碎法和酶消化法组合为大多实验室所认可。酶的使用又包括胶原酶、胰酶、DNA酶等。本实验在经历了挤压法获得子宫内膜、刮取法获得子宫内膜加少量肌层、全子宫剪碎消化分离培养,胶原酶+DNA酶消化法、胶原酶加胰酶消化法等不同组合次数的摸索,最后确定选择(0.1%胶原酶+0.08%胰酶)2次消化法,70 μm细胞过滤器过滤后可获得较为纯净的子宫内膜单细胞悬液。

目前,根据来源或者不同的分离手段将子宫内膜干细胞主要分为:间充质干细胞、上皮干细胞、SP干细胞、经血源性干细胞、子宫内膜再生细胞等[2]。常规贴壁分离培养所含细胞分为子宫内膜上皮干细胞和间充质干细胞。子宫内膜上皮干细胞含量较少,约占子宫内膜干细胞总数的5%,分离不易且体外培养困难[6]。间充质干细胞含量较多,主要位于基质和肌层交界处。研究发现,间充质干细胞来源于发育早期的中胚层[7],不同来源包括骨髓[16]、脂肪[17]、脐带[18]等的间充质干细胞都具有类似的特性。鉴此,本实验选择了STEMCELL Technologies公司的MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)作为细胞培养液,该细胞培养液专为富集小鼠骨髓间充质干细胞设计,并配合低氧环境进行培养,实验发现在此环境下,子宫内膜干细胞生长状态良好,增殖明显。

常规干细胞的鉴定包括形态观察,克隆形成实验,流式细胞仪对细胞表面标记进行分析、免疫组化鉴定等。本实验结果显示培养所获子宫内膜干细胞形态学特征与文献报道[13]较为一致,且增殖力强。通过流式细胞仪对细胞表面标记进行分析是近年来应用最为广泛的一种鉴定手段。Deane等[19]实验结果显示,来源于成年小鼠子宫的间质细胞高表达CD90和CD44,低表达CD45和EpCAM。Chan等[5]研究认为,小鼠子宫内膜干细胞在表达sca-1、CD31、α-SMA的同时也表达雌激素受体(ERα)和Ki-67(增殖标志),不表达c-Kit。部分学者研究结果显示子宫内膜干细胞中CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD140、CD146等均表达阳性[20,21]。李建国等[22]研究表明小鼠骨髓间充质干细胞高表达CD29和CD44,基本不表达CD45和CD11b,赵文秀等[23]研究显示小鼠脂肪间充质干细胞高表达CD29和CD44,不表达CD34、CD45、CD11b、CD14。参考文献及相关预实验,本实验最后决定选择CD29、CD45、CD73、CD105、CD117(c-kit)作为鉴定标记,实验结果显示本实验所培养的小鼠子宫内膜干细胞表达CD29,CD73,CD105,不表达CD45、CD117。通过以上实验,可以确定本实验所分离培养的为小鼠子宫内膜间充质干细胞。

子宫内膜是对女性维持生理功能和生育功能有着重大意义的部分,也是辅助生殖领域影响胚胎着床的关键因素[24]。子宫内膜干细胞的深入研究,对子宫内膜功能改善、子宫疾病治疗有着积极的影响。因此,在人类子宫内膜研究较为受限的情况下,全方位研究小鼠子宫内膜干细胞,为人类子宫内膜干细胞的研究与应用提供相关数据支撑。