甄亚男,甄 诚,葛贤明,郭 滨,魏 芳,韦颖梅,刘 浩

(蚌埠医学院药学院安徽省生化药物工程技术研究中心,蚌埠 233030;*通讯作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通讯作者,E-mail:bbmcwym@163.com)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、进行性、多发性、侵袭性的,并以关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫性疾病[1,2]。大量研究表明,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)在RA中异常活化,是RA滑膜病理过程中的关键参与者[3-5]。因此,通过抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖、侵袭和迁移能力,可有效控制滑膜炎症,保护关节软骨和骨。

研究表明,在富含氧自由基、NO和细胞因子的微环境中,RA-FLS表现出多种肿瘤细胞样特征[6]。尤其糖代谢在RA发生发展过程中发挥了重要的作用,多种与糖代谢相关的关键酶在RA中表达增高[7,8],并且对葡萄糖转运蛋白1、单羧酸转运蛋白和6-磷酸果糖-2激酶的抑制,或丙酮酸脱氢酶的激活,均显示出可抑制RA-FLS的增殖,改善小鼠炎症性关节炎[6,9-12]。在RA-FLS中发现的代谢变化可能是风湿性疾病发病的新机制,而以代谢功能障碍为靶点可能为RA提供新的治疗途径。

BAY-876是葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)抑制剂,竞争性抑制葡萄糖转运蛋白的反应,限制了后续进行的糖代谢等过程,减少ATP的产生,促使细胞死亡[13]。本研究旨在观察GLUT1抑制剂BAY-876对类风湿关节炎滑膜细胞增殖、迁移及侵袭的作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司,胎牛血清购自浙江天杭生物科技公司BAY-876购于美国Selleck公司,兔抗人MMP-2、MMP-9、AKT抗体、鼠抗人β-actin抗体购于英国Abcam,CCK-8、ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞株及细胞培养

类风湿性关节炎滑膜细胞(RA-FLS)购自BeNa Culture Collection(BNCC),冻存培养于蚌埠医学院生化药理实验室。人类风湿性关节炎滑膜细胞培养于含10%新生胎牛血清的DMEM高糖培养基中(青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L),置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的RA-FLS细胞接种于96孔板中,7 000个/孔。培养24 h后弃去培养液,加入梯度浓度BAY-876处理细胞,同时设调零孔和空白培养基对照组,BAY-876的药物浓度为0.5,1,2,4,8 μmol/L,每组设5个复孔。药物处理培养24,48,72 h后,每孔加入10 μl CCK-8,37 ℃烘箱孵育1 h。肉眼观察细胞孔中颜色由黄色变成深橙色,于酶标仪中读取波长450 nm处的吸光度值(optical density,OD)。以上实验重复3次。计算细胞的存活率:细胞存活率(%)=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.4 细胞内ATP水平的检测

取对数生长期的RA-FLS细胞种于6孔板中,2.5×105个/孔,培养箱中培养24 h后,分为4组,加入含有不同浓度(0,2,4,8 μmol/L)BAY-876的培养液处理4 h,加入适量ATP裂解液收集细胞并转移至1.5 ml EP管中,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min取上清用于后续分析。使用ATP测定试剂盒(碧云天)进行检测。实验重复3次。

1.5 细胞划痕实验

六孔板背面垂直于横轴、每隔0.5-1.0 cm用记号笔划线。取对数生长期RA FLS细胞接种于6孔板中,5×105个/孔。待生长至90%融合时,用200 μl枪头垂直于板面,沿标记线划痕。用PBS洗两次,洗去划下的漂浮细胞。加入含有不同浓度(2,4,8 μmol/L)BAY-876的无血清培养基,置于5% CO2,37 ℃,饱和湿度环境下培养。同时设置空白对照组(0 μmol/L BAY-876,即不含药物培养基组),每组均设3个复孔,实验重复3次。加入不含血清培养基后,在0 h和18 h分别于倒置显微镜下拍照观察。计算细胞迁移率:细胞迁移率=(0 h划痕面积-培养18 h后划痕面积)/0 h划痕面积×100%。

1.6 Transwell侵袭实验

将Materigel胶与预冷的无血清DMEM培养基按1 ∶8的比例稀释,用预冷的200 μl枪头以每孔60 μl均匀包被Transwell小室底部膜的内表面,放入细胞培养箱30 min以上使之成胶。取对数生长期的RA-FLS细胞,经消化离心后,用无血清培养基进行重悬计数,每个内室内加入200 μl药物浓度分别为0,2,4,8 μmol/L的细胞悬液,除阴性对照组外每孔均含5×105个细胞。于24孔板即外室中加入800 μl含10% FBS的DMEM培养基。加入后1 h内每10 min观察一次下室避免有气泡产生。该实验分为空白对照组(0 μmol/L BAY-876,即不含药物培养基组)、不同浓度BAY-876(2,4,8 μmol/L)组,每组均设三个复孔。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养48 h;取出小室,PBS清洗两次,4%多聚甲醛固定15 min;用PBS湿润的棉签轻轻擦去上室表面未侵袭的细胞,用1%结晶紫染液室温下染色10 min;PBS漂去多余染料,显微镜下每孔随机取5个视野拍照,计数并求平均值。

侵袭抑制百分率(%)=(1-实验组细胞侵袭数/空白对照组细胞侵袭数)×100%。

1.7 Transwell迁移实验

除无需铺基质胶外,其余处理步骤同1.6中所述内容,所有实验重复三次。

迁移抑制百分率(%)=(1-实验组细胞迁移数/空白对照组细胞迁移数)×100%。

1.8 Western blot检测MMP-2、MMP-9及AKT蛋白的表达

将细胞接种于60 mm平皿48 h后,收集细胞,加入适量的蛋白裂解液,冰上裂解30 min。4 ℃低温离心机12 000 r/mim离心30 min,提取蛋白上清,使用BCA法进行蛋白定量,使各组蛋白至等浓度。每组取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳;转至聚偏氟乙烯膜;用5%脱脂牛奶封闭4 h;PBST溶液洗膜3次,5 min/次;4 ℃一抗过夜,PBST溶液洗膜3次;二抗室温下孵育2 h;PBST溶液洗膜3次,5 min/次;ECL试剂盒暗室发光显影,Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。

1.9 统计分析方法

实验数据采用SPSS21.0统计软件进行统计分析,实验数据均以均数±标准差表示,多组比较采用单因素方差分析及两因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BAY-876对RA FLS的増殖抑制作用

分别用0，0.5,1,2,4,8 μmol/L的BAY-876处理细胞,然后CCK-8法检测24,48,72 h细胞增殖情况,结果显示,各浓度组BAY-876的抑制率明显高于对照组,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),且对RA-FLS增殖的抑制作用呈剂量依赖性,并随着处理时间延长,细胞存活率下降(见图1)。

与0 μmol/L BAY-876比较,*P<0.05图1 BAY-876对RA FLS细胞存活率的影响Figure 1 Effects of BAY-876 on the viability of RA FLS cells

2.2 BAY-876对RA FLS细胞中ATP水平的影响

与对照组比较,2,4,8 μmol/L BAY-876作用4 h均可明显降低RA FLS细胞内的ATP水平(P<0.01),并随着BAY-876浓度增加,RA FLS细胞内的ATP水平显著降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01,见图2)。

与0 μmol/L BAY-876(对照)比较,**P<0.01图2 BAY-876对RA FLS细胞内ATP水平的影响Figure 2 The intracellular ATP level of RA FLS cells after treated with BAY-876

2.3 细胞划痕实验

细胞划痕实验结果显示:2,4,8 μmol/L BAY-876处理组均可抑制RS FLS细胞的划痕愈合速度,而随着剂量增加,与对照组相比,8 μmol/L组明显抑制了划痕的愈合(见图3),与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

与0 μmol/L BAY-876(对照)比较,**P<0.01图3 划痕实验检测BAY-876对RA-FLS细胞迁移能力的影响 (×40)Figure 3 Effect of BAY-876 on the migration of RA-FLS by Transwell assay (×40)

2.4 BAY-876对RA FLS迁移和侵袭能力的影响

Transwell迁移和侵袭实验结果显示,与对照组相比,2,4,8 μmol/L BAY-876作用于RA FLS细胞迁移抑制率分别为(16.2±3.9)%、(60.1±3.0)%和(68.2±2.3)%,侵袭抑制率分别为(62.6±3.3)%、(85.3±3.7)%和(91.8±3.2)%,与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01,见图4)。表明BAY-876可以抑制RA FLS细胞迁移和侵袭活性。

2.5 Western blot检测MMP-2、MMP-9及AKT的表达

Western blot结果表明,2、4、8 μmol/L BAY-876作用于RA FLS细胞48 h,MMP-2、MMP-9及AKT蛋白的表达明显下降(见图5)。

3 讨论

正常细胞主要利用氧化磷酸化获取能量维持细胞的正常生长,而糖酵解上调的细胞群和耐酸性细胞群具有强大的生长优势,可以促进细胞的增殖侵袭。炎症关节微环境的特征是缺氧和低浓度的营养物质[10],与肿瘤的微环境有相似的特征。而GLUT1本身作为葡萄糖转运的一个限速因素,其功能缺失会导致葡萄糖吸收障碍,降低细胞内ATP水平,从而抑制RA-FLS的增殖[14]。BAY-876能特异性抑制糖代谢过程的限速酶GLUT1的活性,使细胞因ATP供应不足而死亡[15]。文献表明BAY-876在食道癌[16],卵巢癌[17]治疗中有较好的抗肿瘤作用。并且在CCK-8实验中明确BAY-876对RA-FLS细胞存活率的影响具有时间和浓度依赖性。通过调控AKT信号通路可降低糖酵解中GLUT1和己糖激酶2的表达,从而抑制滑膜细胞对葡萄糖的吸收和糖酵解过程,也就是说AKT信号通路与滑膜细胞凋亡异常密切相关,异常激活此信号通路是滑膜细胞凋亡失衡的机制之一[18,19]。

与0 μmol/L BAY-876比较,**P<0.01图4 Transwell小室法检测BAY-876对RA-FLS细胞迁移和侵袭能力的影响Figure 4 Effect of BAY-876 on migration and invasion of RA-FLS by Transwell

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组Zn2+、Ca2+依赖的内源性蛋白水解酶家族,可由成纤维细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞合成和分泌,降解ECM[20]。通过抑制分泌活化表达MMPs的细胞及与其作用机制相关的酶类和途径,可能下调MMPs表达并降低其活性,从而抑制RA-FLS的侵袭转移[21]。研究显示MMP-2和MMP-9富有侵袭性伪足,有助于体内外细胞外基质降解[22]。

AKT信号通路是重要的细胞内信号转导通路,细胞的运动以及血管的发生与AKT信号转导通路有关,重要的是AKT信号转导通路还可上调MMP-2蛋白质的表达,MMP-2降解细胞外基质,促进细胞的转移和侵袭[23]。而通过划痕实验和Transwell实验进一步证实BAY-876对RA-FLS的侵袭迁移能力有抑制作用,并且随着浓度的增加,BAY-876对RA-FLS的抑制作用增强。Western blot的结果表明,BAY-876下调MMP-2、MMP-9和AKT蛋白的表达,其机制可能通过AKT通路调控MMP-2和MMP-9来抑制RA FLS的侵袭转移。

综上所述,本研究证明了BAY-876可抑制类风湿性关节炎滑膜细胞的增殖及转移能力,其机制可能是通过抑制AKT信号通路下调MMP-2和MMP-9的表达,但其具体的分子机制有待于进一步研究。