张德信,胡劲松,李少军,张永红,王 珂,李满祥

(1西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科,西安 710004;2西安交通大学医学院;3西安交通大学第一附属医院呼吸与危重症医学科;*通讯作者,E-mail:dexin1994@mail.xjtu.edu.cn)

在肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)进展过程中,肺血管重构是其重要的病理基础,而血管内皮损伤后所致的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)向内膜迁移,最终致使内膜增厚被认为是PAH主要病理机制之一[1]。所以,抑制PASMCs迁移,就可以抑制PAH的发生和发展。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化是细胞迁移及侵袭过程中重要因素,其功能在肿瘤的侵袭机制中得到广泛的研究[2]。FAK可以调节细胞的吸附、肌动蛋白聚合和骨架重组等生理过程,从而促进细胞迁移和侵袭。在PAH发病机制中,FAK是否参与平滑肌细胞迁移,需要进一步研究证实。本研究利用PDGF-BB刺激PASMCs,促进其受体PDGF-βR磷酸化,再分别给予FAK拮抗剂Y15及PPAR-γ激动剂罗格列酮,观察不同干预对于PASMCs迁移的影响,并检测激活PPAR-γ后,PDGF-βR及FAK(Tyr397)磷酸化水平的变化,证实PPAR-γ、PDGF-βR和FAK在平滑肌细胞迁移中的关系。进一步研究PASMCs迁移的分子调控机制,探索抑制PASMCs迁移的分子通路,为PAH靶向治疗提供新依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

清洁级4-6周雄性SD大鼠,体质量150-200 g,由西安交通大学实验动物中心提供。青霉素(哈尔滨制药厂),链霉素(华东制药厂),0.25%胰酶、DMEM-12培养基、标准胎牛血清(美国HyClone公司);兔抗大鼠α-SMA(美国Abcam公司);DAB显色试剂(北京中山生物技术公司);预铺Ma-trigel胶的Transwell小室(美国Corning公司);重组人血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)、抗p-PDGF-βR(Tyr751,美国Cell Signaling公司);抗p-FAK(Tyr397)抗体(美国Life Technologies);1,2,4,5-苯四胺盐酸盐(Y15,美国sigma公司);Rosiglitazone(美国Cayman公司)。

1.2 大鼠PASMCs的原代培养、鉴定

颈椎脱臼法处死SD大鼠,无菌分离肺动脉中膜层,剪切后的组织块贴壁于培养瓶,加入DMEM-12培养基(含20% FBS),37 ℃、5% CO2培养。组织块长出细胞后,根据细胞形态、免疫组化检测血管平滑肌细胞表型标志基因α-SMA的表达,鉴定PASMCs。取第3-7代细胞用于实验。

1.3 实验分组及处理

取传代培养3-7代细胞用于实验,接种PASMCs(约5×104/孔)于6孔板,当细胞融合度约40%-60%时,换用无血清DMEM-12培养基,同步化处理24 h,将细胞分为CON组、PDGF-BB组、Y15组和ROSI组。CON组:加入含10% FBS的高糖DMEM-12培养基,不加入刺激因子及抑制剂;PDGF-BB组:根据预实验结果,细胞同步化后加入20 ng/ml PDGF-BB刺激1 h,裂解细胞,提取蛋白,Western blot检测PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。Y15组:同步化后加入PDGF-BB(20 ng/ml)预刺激1 h,再加入FAK抑制剂Y15(10 μmol/L)刺激2 h后裂解细胞,提取蛋白,Western blot检测PDGF-βR和FAK(TYR397)磷酸化水平。ROSI+PDGF-BB组:依据预实验结果,同步化后加入罗格列酮10 μmol/L预处理1 h后加入20 ng/ml的PDGF-BB刺激1 h,收集细胞,Western blot检测PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。

1.4 划痕实验

将2×106个PASMCs接种于6孔板,常规培养至90%的融合状态,用10 μl Eppendorf Tip在细胞板上划痕,按实验分组加入相应试剂,37 ℃,5% CO2培养48 h,在0、48 h取样拍照,进行组间比较。随机选择3个区域,计算迁移率。迁移率(%)=(初始划痕面积-48 h后划痕面积)/初始划痕面积×100%。

1.5 细胞迁移实验

采用Transwell培养板进行体外细胞迁移实验:将Transwell放在24孔板内,细胞计数后,配制细胞悬液;在上室每孔加入100 μl DMEM-12无血清培养基;下腔室中加入500 μl含有100 ml/L FBS条件培养基;在上室每孔加入相应干预因子的细胞1.0×105个,孵育24 h;显微镜下观察。200倍高倍视野计数迁移至滤膜下表面的细胞数,反映PASMCs迁移能力。随机计数3个视野内的细胞数,取平均值进行组间比较,实验重复3次。

1.6 Western blot检测p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)磷酸化程度

将各组细胞裂解液提取的蛋白样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度,稀释后用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离,湿法转印,ECL化学发光显色,暗室中拍片,以β-actin作为内参,将结果扫描成电子图像,以Quantity One分析软件(Bio-Rad,USA)分析图像。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 PASMCs的培养及鉴定

大部分组织块接种培养3 d左右,组织块周围有细胞呈放射状生长,早期细胞形态大小不一。经反复传代及纯化,第4代时平滑肌细胞纯度可达95%以上。显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或带状,有多个细胞突起。细胞生长致密时平行排列成束,部分重叠。培养第5代的细胞,经特异的α-actin免疫化学染色后证实为平滑肌细胞。

2.2 划痕实验检测PASMCs迁移结果

PDGF-BB组PASMCs经20 ng/ml PDGF-BB干预48 h后,迁移能力明显提高,表现为划痕区域的面积变化(77.3%±4.2%)高于CON组(61.3%±3.5%,P<0.05)。经PDGF-BB和FAK抑制剂Y15共同处理后,Y15组划痕区域的面积较PDGF-BB干预组变化明显减小(72.7%±4.7%vs77.3%±4.2%,P<0.05);经PDGF-BB和罗格列酮共同处理后,ROSI组划痕区域的面积变化较PDGF-BB干预组明显减小(75.3%±4.04%vs77.3%±4.2%,P<0.05),但与Y15组比较,划痕区域的面积变化差异无统计学意义(75.3%±4.04%vs72.7%±4.70%,P>0.05,见图1)。

与CON组比较，#P<0.05；与PDGF-BB组比较，*P<0.05图1 划痕试验检测各组细胞在Y15干预、激活PPAR-γ后对于PDGF-BB诱导的PASMCs迁移的影响Figure 1 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on PDGF-BB-induced migration of PASMCs by scratch test

2.3 Transwell迁移小室实验结果

PDGF-BB可明显增加PASMCs细胞穿过微孔滤膜的能力,与CON组比较差异有统计学意义(70.7±3.1vs48.7±2.2,P<0.05)。而在上室加入PDGF-BB和FAK抑制剂后,Y15组细胞穿膜数较PDGF-BB组明显减少(70.7±3.1vs51.0±1.3,P<0.05);经PDGF-BB和罗格列酮共同处理后,ROSI组细胞穿膜数较PDGF-BB组也明显减少(70.7±3.1vs48.7±2.9,P<0.05),但与Y15组比较,穿膜细胞数变化差异无统计学意义(51.0±1.3vs48.7±2.9,P>0.05,见图2)。

2.4 Western blot检测PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平

PDGF-BB可明显提高PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化程度。与CON组比较,PDGF-BB组p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表达差异有统计学意义(P<0.05);给予Y15干预后,同PDGF-BB组比较,Y15组p-PDGF-βR表达差异无统计学意义(P>0.05),而p-FAK(Tyr397)则明显降低(P<0.05);给予罗格列酮干预后,与PDGF-BB组比较,p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表达水平均降低,差异具有显著性(P<0.05,见图3)。

与CON组比较，#P<0.05；与PDGF-BB组比较，*P<0.05图2 Transwell迁移小室检测对各组细胞在Y15干预、激活PPAR-γ后对于PDGF-BB诱导的PASMCs侵袭能力的影响Figure 2 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on invasive ability of PAGF-BB-induced PASMCs by Transwell migration chamber assay

与CON组比较，#P<0.05；与PDGF-BB组比较，*P<0.05；与Y15组比较，△P<0.05图3 Western blotting检测Y15干预、激活PPAR-γ后，p-PDGF-βR、p-FAK(Y397)磷酸化水平的变化Figure 3 Changes of phosphorylation levels of p-PDGF-βR and p-FAK(Y397) after Y15 intervention and activation of PPAR-γ by Western blotting

3 讨论

PASMCs迁移和增殖是PAH发生发展的重要环节,抑制PASMCs迁移和增殖是目前治疗PAH发生和发展的重要策略。本课题组近期的研究结果提示,通过激活PPAR-γ,可上调血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白的表达,上调的HO-1又可上调周期蛋白p21(WAF1)的表达,最终可抑制血管平滑肌细胞的增殖[3]。本实验利用罗格列酮激活PPAR-γ后,研究其对于PASMCs迁移作用及可能机制。PASMCs的迁移需要化学趋化剂,再通过多种分子通路,使PASMCs向血管内膜迁移,参与血管重构。PDGF-BB就是最为重要的驱化剂之一[4]。本实验利用PDGF-BB作为趋化因子,刺激PASMCs迁移,研究激活PPAR-γ后对于PASMCs迁移的影响及可能的机制。本实验结果提示,激活PPAR-γ可明显抑制PASMCs的迁移,这种抑制作用部分机制可能是通过抑制PDGF-βR磷酸化,进一步抑制FAK(Tyr397)磷酸化水平而实现的。

PAH病因复杂,参与其发病的因素包括肺血管收缩与重构,肺血管平滑肌和内皮细胞的异常增殖,血栓形成及遗传基因变异等[5]。肺血管内皮细胞的增殖迁移是其重要环节,这一过程与PPAR-γ关系密切[6]。研究发现,PAH患者的PPARγ的表达无论在基因水平还是在蛋白水平都有明显降低;在对重症PAH的肺组织进行抗PPARγ单克隆抗体的免疫染色时,发现肺血管的丛样病变处PPAR-γ的表达明显减少[7]。在PAH动物模型中,激活PPAR-γ后,肺动脉压力明显降低,这一作用是通过降低PASMCs的增殖和迁移实现的[8]。

FAK在多种细胞的迁移、增殖、分化、凋亡等的调节中具有关键作用,是细胞周期的正向调节因子。过度表达的FAK不但可以增加DNA的合成,促进细胞增殖,还可以促进细胞迁移;突变的FAK则可以抑制细胞迁移[9]。目前研究较多的是FAK在肿瘤细胞转移过程中的作用[10]。FAK磷酸化是调控细胞迁移的基础,而在所有FAK磷酸化位点中,FAK(Tyr397)的磷酸化处于核心位置,其磷酸化后可催化FAK的Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861和Tyr925等位点磷酸化,最终使FAK完全活化[11]。研究证实,血小板衍生生长因子PDGF-BB可引起血管平滑肌细胞FAK表达升高与活化,而活化的FAK可通过多种途径促进细胞迁移及增殖[12]。而这一作用机制是否参与到PAH的形成过程中,并没有得到证实。本实验结果提示,PASMCs经PDGF-BB干预后,迁移能力明显提高,表现为划痕区域的面积变化和Transwell迁移小室迁移细胞数明显高于CON组,且PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平明显较CON组提高,提示PDGF-BB可通过促进PDGF-βR磷酸化,进而提高FAK磷酸化水平,促进PASMCs迁移。给予FAK拮抗剂Y15干预后,PASMCs迁移能力减弱,同时伴有FAK(Tyr397)磷酸化水平明显降低,PDGF-βR磷酸化水平无明显变化,提示磷酸化的FAK参与到PASMCs迁移过程中。再次激动PPAR-γ后,PASMCs迁移再次受到抑制,而PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平同PDGF-BB组比较显著降低。本实验结果提示,激动PPAR-γ可以抑制肺动脉高压的形成,部分原因可能是通过抑制PDGF-βR磷酸化,进而抑制FAK的磷酸水平,最终抑制PASMCs的迁移来实现的。

尽管本实验结果证实了激动PPAR-γ抑制PASMCs迁移的可能机制,但激动PPAR-γ抑制PASMCs迁移尚存在多个信号通路、关键的靶蛋白及对应的靶基因[13,14],仍需通过相关抑制剂或基因沉默干扰技术进一步研究,从而更好地理解PPAR-γ在PAH治疗中的作用机制。