秦泗佳,刘昌奎,苏军龙,张军峰2,

(1西安医学院口腔医学院口腔解剖生理学教研室,西安 710021;2陕西省脑疾病防治重点实验室;3西安医学院口腔医学院口腔颌面外科学教研室;4西安医学院基础医学部人体解剖学教研室;*通讯作者,E-mail:2004075332@163.com)

三叉神经痛是指三叉神经所支配的区域发生的强烈的阵发性疼痛。国内外学者对其发病机制的认识尚不完全清楚,相继提出了许多学说,但比较公认且有显微解剖学证据的是局部微血管压迫学说。三叉神经的血液供应主要来自基底动脉的脑桥支及小脑下前动脉,已有学者详细报道了它们在神经外的起源和分布[1-5],但对三叉神经节内微血管的具体分布特点仍不清楚。本实验主要研究SD大鼠三叉神经节内微血管的分支、分布及走行特点,为三叉神经痛发病机制的研究提供解剖学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠2只,体质量200-220 g,购于大连医科大学SPF实验动物中心,雄性。

1.2 实验试剂和软件

明胶(上海国药集团化学试剂有限公司);一得阁墨汁(北京);伊红-苏木素染液;体视镜(OLYMPUS SZ2-ST);光学显微镜(OLYMPUS BX43);焦点堆迭软件(Zerene Stacker 1.02)。

1.3 灌注、取材及切片

腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露心脏，左心室插管，右心耳放血，快速灌注0.9%氯化溶液，至流出液清亮，4%多聚甲醛灌注，随后用过滤的37 ℃ 5%明胶-墨汁混合液灌注，至大鼠眼结膜和口唇及全身皮肤变黑为止，结扎肺动脉、肺静脉、主动脉弓和上、下腔静脉，-4 ℃冷冻15 min。开颅后在三叉神经根与脑连接处剪断，仔细分离并去除三叉神经节周围的骨组织，剪断并获取三叉神经节(左右各2个)，放入4%多聚甲醛固定液内固定24 h，蒸馏水洗10 min，体视镜下去除三叉神经节外膜，经梯度酒精脱水和二甲苯透明后制作明胶-墨汁灌注透明标本，体视镜下观察，并进行不同焦距层面的拍照。将明胶-墨汁灌注的透明标本经无水乙醇去除二甲苯后行石蜡包埋，切片(厚10 μm)，60 ℃烤片3 h，经脱蜡、水化，HE染色，再经二甲苯透明和中性树胶封片后，在光学显微镜下观察并进行拍照。

1.4 图像及切片处理

将体视镜下所得的不同焦距层面的图像导入到Zerene Stacker软件中进行焦点堆迭。HE染色的切片,光学显微镜下取不同部位放大400倍拍照。

2 结果

2.1 SD大鼠三叉神经节的焦点堆迭

在体视镜下,将SD大鼠三叉神经节放大3.2倍,每侧共获取不同焦距层面的图像22张,然后进行焦点堆迭后获得1张图像(见图1)。SD大鼠三叉神经节不同焦距层面的图像能够清晰显示该焦距层面部分血管的分支、分布及走向,另一部分则被其他层面的组织遮挡显得模糊(图1A-E)。焦点堆迭的图像可以清晰显示整个大鼠三叉神经节内微血管的分支、分布及走向(图1F)。下颌神经神经元胞体聚集区微血管的数量多,血管密度大,颜色很深,血管在不同层面发出分支不断交互吻合形成立体的微血管网,然后顺神经纤维方向分支顺行,密度随之降低,颜色变浅。上颌神经-眼神经干神经元胞体聚集区较大,微血管的数量亦众多,血管密度大,颜色深,血管在不同层面发出分支不断交互吻合形成立体的微血管网,然后沿神经纤维方向分支顺行,密度随之降低,颜色变浅。在两大神经元胞体聚集区之间近下颌神经分叉处的微血管的数量和密度比上颌神经-眼神经干神经元胞体聚集区近心端内侧面的微血管数量和密度要大,血管分支多,颜色深。

A-E.不同层面的图像;F.焦点堆迭后的图像;1.下颌神经;2.上颌神经-眼神经干图1 SD大鼠左侧三叉神经节不同焦点层面及焦点堆迭后图像 (×3.2)Figure 1 Image of left trigeminal ganglion of SD rats at different focal levels and after focus stacking (×3.2)

2.2 SD大鼠三叉神经节切片的HE染色

将SD大鼠三叉神经节切片后行HE染色,镜下放大400倍后获取不同部位的图像。在神经元胞体聚集区,神经元胞体与胞体之间分布着大量的微血管,管径较小,密度较大,分支分叉交互成网包绕在神经元胞体周围(见图2A)。在神经元胞体聚集区与神经纤维聚集区交界处仍可见靠近神经元胞体聚集区的微血管数量比靠近神经纤维聚集区的微血管数量要多,微血管的断面逐渐变长,说明微血管的走行方向由神经元胞体聚集区的网状逐渐向沿神经纤维纵向走行的方向过渡,微血管的密度降低,但血管的直径有所增加(见图2B)。在神经纤维聚集区,微血管的密度进一步降低,血管的长度进一步增长,方向也呈现顺沿神经纤维长轴方向延伸,在走行过程中可斜向或纵向发出分支分叉吻合成网,但密度较神经元胞体聚集区小(见图2C)。

A.神经元胞体聚集区 B.神经元胞体与神经纤维交界区 C.神经纤维聚集区图2 SD大鼠三叉神经节切片HE染色 (×400)Figure 2 HE staining of trigeminal ganglion sections in SD rats (×400)

3 讨论

近年来的研究表明,三叉神经痛发病机制有多种学说或假设及其相应的治疗方法,目前关于神经受压迫使神经微循环障碍致神经脱髓鞘变而产生神经痛的周围学说占主流[6-8]。研究大鼠三叉神经的微血管的分支、分布及走行规律可为探究人三叉神经痛的发病机制提供方法。但是,大鼠的三叉神经节与人的三叉神经节的解剖结构存在较多差别,大鼠的三叉神经节发出下颌神经和上颌神经-眼神经干,即上颌神经和眼神经合为一个神经干。神经干近段走行于大脑的腹侧,两支近乎平行向前稍内侧走行,颈内动脉及其分支伴行并营养之;下颌神经的主干较短,起于三叉神经节的外侧,行向前外,出颅后即分为数支。

焦点堆迭是用多张不同焦点的照片,它们的对焦点在同一背景上拼接呈一幅照片[9]。本研究每侧三叉神经共获取不同焦点层面的照片22张,进行焦点堆迭后合成1张照片(图1F),该照片可清晰显示整个大鼠三叉神经节内微血管的分支、分布及走向。下颌神经和上颌神经-眼神经干神经元胞体聚集的区微血管的数量多,血管密度大,颜色深,血管在不同层面发出分支不断交互吻合形成立体的微血管网。在神经节前外侧部近下颌神经分叉处的远心端微血管的数量和密度比上颌神经-眼神经干神经元胞体聚集区近心端内侧面的微血管的数量和密度要大,血管分支多,颜色深。有研究已利用此技术进行了大鼠三叉神经痛模型三叉神经和眶下神经微循环变化的研究,结果均能很好地显示三叉神经痛模型神经内微循环随着时间推移的变化[10,11]。

本研究用过滤的40 ℃ 5%明胶-墨汁混合液灌注SD大鼠，游离三叉神经并去除神经外膜，经石蜡包埋切片后行HE染色。明胶-墨汁灌注能很好地显示血管，尤其是微血管，而HE染色又能很好地显示神经元胞体和神经纤维，将两者结合起来就能显示神经与血管的关系，显示神经内微血管的分支、分布及走行规律[12]。在神经元胞体聚集区分布着大量的微血管,管径较小,密度较大,分支分叉交互成密网包绕在神经元胞体周围。在神经纤维聚集区微血管的密度较小,血管的长度增长,沿神经纤维长轴方向延伸,可斜向或纵向发出分支分叉吻合成疏网。在神经元胞体与神经纤维的交界区近神经元胞体聚集区的微血管数量比近神经纤维聚集区的微血管数量要多,微血管的走行方向由神经元胞体聚集区的网状逐渐向沿神经纤维纵向走行过渡,微血管的密度降低,断面逐渐变长,直径增大。此结果说明,在需氧量和能量较多的区域微血管的数量多、密度大、呈密网状,在相对需氧量和能量少的区域微血管数量少、密度小、沿长轴呈疏网状,符合神经生理解剖及功能需要的特点。