姚晶瑞 ，姜埃利 ，王立华 ，魏 芳 ，陈海燕 ，于海波 ，孟 甲

（1.天津医科大学第二医院肾脏病血液净化科，天津300211；2.天津市海河医院肾内科，天津300350）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）最常见的微血管并发症之一，为引发终末期肾功能衰竭的首要原因[1-2]。研究表明，我国成人糖尿病患病率逐年增高，目前糖尿病患者人数已近1.139亿，预计至2030年患者人数将超过1.8亿。这些患者中超过1/3的患者有可能发展为DN以及肾功能衰竭等，因此DKD一直是T2DM患者致残和致死的重要原因之一[3-4]。研究提示糖脂代谢紊乱所引起的氧化应激是T2DM多种并发症的共同机制之一。线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成过多与多种T2DM并发症发生存在关联[5-6]。线粒体是高糖诱导ROS产生的重要部位。一方面，高血糖首先引起细胞内线粒体ROS生成增加，导致线粒体功能障碍进而活化氧化应激通路而引发组织损伤；另一方面，血糖升高时三羧酸循环生成大量还原性电子载体，使为ROS生成提供电子的中间物质存在时间延长，也促进了ROS的生成[7-8]。雷公藤甲素（triptolide,TP)是目前已知的可以从中药雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物,也是雷公藤的主要有效药用成分之一。雷公藤甲素具有免疫抑制、抗炎及抗肿瘤等生物活性[9-10]。近年研究结果显示TP治疗DKD也具有一定效果，推测TP主要是通过调控氧化应激相关通路来完成[9-11]。因此，本研究旨在从TP调控氧化应激角度进一步研究TP对DKD的改善作用，并探讨其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 雷公藤甲素购自中国国家药品生物制品检定所。RDX2抗体购自abcam公司，肾小球系膜细胞实验室自留。DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购买自Hyclone公司。D-葡萄糖购买自天津索罗门生物科技有限公司。人肾小球系膜细胞（HRMCs）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 实验动物 KK-Ay小鼠30只和C57小鼠15只购买自北京华阜康科技股份有限公司。8周龄，雄性，体质量（22±1.6）g。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 小鼠在恒定室温和湿度条件下适应性喂养1周后，KK-Ay小鼠随机分为2组，每组15只，分别为模型组和TP干预组。C57小鼠作为对照组。各组分笼喂养，保持自由饮水和标准饮食，定期消毒。TP干预组采用灌胃的方法，每天1次，200 μg/kg/d，连续灌胃12周。对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃12周。

人肾小球系膜细胞使用1640基础培养基和浓度为5%的胎牛血清配制完全培养基，置于恒温30℃，5% CO2的恒温培养箱中进行培养。正常生长的人肾小球系膜细胞接种于6孔板培养24 h后，分为3组，即继续普通培养基培养的对照组、培养基中给予30 mmol/L D-葡萄糖培养24 h的高糖组及30 mmol/LD-葡萄糖和TP（10 μg/L）共同处理24 h的干预组。

1.3.2 病理学检查 于小鼠模型造模后12周，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下取出各组小鼠肾脏组织，10%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，从肾脏组织中心部位连续切片，切片厚度为4 μm，行苏木精-伊红（HE）染色，倒置相差显微镜下观察肾脏组织的形态学改变。

1.3.3 氧化应激因子检测 小鼠模型造模后12周，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，无菌条件下取出各组小鼠肾脏组织，充分研磨消化后离心，3 000 r/min离心10 min取上清液。人肾小球系膜细胞加入0.25%胰酶消化后，血清中止消化，收集细胞，1 000 r/min离心8 min，将培养液吸净后加入500 μL 0.01 mol/L PBS，混匀制成细胞悬液，使用细胞超声仪中进行细胞破碎，每次5 s，连续20次，间隔10 s，总取样量为200 μL。根据ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定并计算丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性。

1.3.4 硫氧还蛋白过氧化物酶2（Peroxiredoxin-2，PRDX2）蛋白检测 采用Western blot检测方法。收集各组小鼠肾脏和各组细胞，提取蛋白后95℃变性7 min，取上清和Marker分别上样，于10%的SDSPAGE凝胶电泳分离，转膜至硝酸纤维素膜，含50 g/L脱脂奶粉TBST封闭后，以PRDX2和βactin抗体4℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，ECL显影，凝胶成像系统分析。实验重复3次。

1.3.5 免疫荧光检测 ROS分析试剂盒（Beyotime Biotechnology Co.Ltd，S0033-1，中国上海）是一种利用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平的试剂盒。根据说明书进行染色分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件分析数据（IBM公司，美国），数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DKD小鼠肾脏损伤情况 观察HE染色结果显示，对照组小鼠肾脏肾小球形态规则，无明显肾小球基底膜增厚及其他明显病变；模型组可见小鼠肾脏肾小球体积略增大，肾小球基底膜明显增厚、系膜基质增生，部分肾小球内皮细胞呈空泡变，而TP治疗后的小鼠肾脏肾小球的上述病理改变均有不同程度改善（图1）。

图1 小鼠肾脏病理形态学观察Fig 1 The morphological observation of mouse glomeruli in each group

2.2 DKD小鼠肾脏氧化应激因子的测定 ELISA检测结果显示，模型组小鼠肾脏组织SOD活性明显低于对照组（图2A，P＜0.05），MDA含量明显高于对照组（图 2B，P＜0.05）。相对于模型组，经 TP 干预，小鼠肾脏组织中SOD活性提高，MDA含量有所减低（图 2）。

2.3 DKD小鼠肾脏PRDX2的蛋白表达 Western blot结果显示，模型组PRDX2表达量明显低于对照组，而干预组明显高于模型组，见图3。

图2 TP对DN小鼠肾脏氧化应激状态影响Fig 2 The effects of TP on oxidative stress in mouse kidney

图3 TP对DN小鼠肾脏PRDX2表达量的影响Fig 3 The effects of TP on PRDX2 protein expression levels in mouse kidney

2.4 人肾小球系膜细胞氧化应激因子的测定 高糖组细胞中ROS的产生明显高于对照组，而经TP干预后，人肾小球系膜细胞中ROS的产生减少（图4A）。ELISA检测结果显示，高糖组细胞SOD活性明显低于对照组（图 4B，P＜0.05），MDA 含量明显高于对照组（图4C，P＜0.05）。相对于模型组，经TP干预，人肾小球系膜细胞中SOD活性有所升高，MDA含量有所减少（图 4B、4C）。

图4 TP对人肾小球系膜细胞氧化应激状态影响Fig 4 The effects of TP on oxidative stress in human mesangial cells

2.5 人肾小球系膜细胞PRDX2的蛋白表达 Western blot结果显示，人肾小球系膜细胞经高糖诱导后细胞中PRDX2蛋白表达量明显低于对照组（图5，P＜0.05）；但高糖组细胞经TP干预后，细胞中PRDX2蛋白表达量明显增加（图 5，P＜0.05）。

图5 TP对人肾小球系膜细胞PRDX2表达量的影响Fig 5 The effects of TP on PRDX2 protein expression levels in human mesangial cells

3 讨论

雷公藤是一个有着悠久历史的中药。TP作为雷公藤的主要活性成分之一，具有多种生物活性，其最初提取于雷公藤的根，目前已知其具有抗氧化、抗类风湿、抗老年性痴呆症、抗癌等功效。随着相关领域对T2DM及其多种并发症研究的不断深入，近年来有学者提出TP对于DKD具有治疗价值，具有潜在地改善肾脏损伤的能力[12-13]。DKD肾脏一般首先发生损伤的为内皮细胞,随后引起毛细血管通透性增加,蛋白等成分漏出至肾小球囊,继而刺激壁层上皮细胞增生[14]。本研究小鼠模型肾脏的病理特征也支持此结论；研究中DKD组小鼠出现肾小球体积略增大，肾小球基底膜明显增厚、系膜基质增生，部分肾小球内皮细胞呈空泡变性，而经TP治疗后的肾小球上述病理改变有不同程度改善。研究报道TP可能通过调控DKD肾脏组织氧化应激状态而发挥治疗作用[15-16]。因此本研究亦从TP调控氧化应激角度进一步研究了TP对DKD的改善作用，并探讨其作用的分子机制。

既往有研究选取新诊断未接受任何治疗措施的T2DM患者进行研究，发现机体的氧化应激程度在单纯的T2DM病理背景下即表现出增高的特征[17]；葡萄糖不耐受个体可以通过自我调节完成纠正或者成功代偿,最终保持机体的总抗氧化能力尚维系在正常范围内[17-18]；但是随着胰岛素抵抗指数以及体质指数的增高机体的氧化应激水平表现出明显的增高趋势，提示肥胖、胰岛素抵抗等在破坏T2DM患者氧化应激稳态过程中也发挥着重要作用[17-18]。DKD的存在又常常与胰岛素抵抗等因素重叠存在[19-20]，因而DKD患者群体普遍存在氧化应激稳态失衡状况[19-21]。临床上使用多种血生化指标来间接反映机体氧化应激状态，比如超氧化物歧化酶SOD可以消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，是生物体内重要的抗氧化酶。SOD已被证实是生物体内清除自由基的首要物质，同多种器官组织的氧化应激状态关联密切[22-23]。MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，可以作为交联剂促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，从而改变生物大分子的功能，因此临床也常常通过检测血清MDA含量来反映脂质过氧化程度[24-25]。本研究体内外实验结果均显示，与相应对照组相比，DKD小鼠模型组肾脏中和人肾小球系膜细胞高糖刺激模型组细胞中均存在SOD活性明显下降、MDA含量明显增加现象，而TP干预后，较模型组相比，TP干预可明显升高SOD活性和降低MDA含量，说明TP确实能抑制DKD肾脏组织中的氧化应激现象。

PRDX2属于过氧化物酶家族的成员，具有利用硫氧化物还原酶作为电子供体来还原过氧化氢，清除细胞内活性氧分子，维持机体氧化还原平衡的功能。PRDX2已经被发现能够通过多种信号途径参与氧化应激过程，特别是在不同病理背景下，机体出现代谢过旺，由此引发的缺氧环境使ROS增多，为了能够在高水平活性氧环境中生存，细胞就必然需要增加抗氧化剂，因而出现了包括PRDX2蛋白在内的相关因子表达变化[26-27]。既往研究提示，PRDX2过表达可以保护氧化应激诱导的胰腺β细胞凋亡，减少糖尿病发生的危险性。DKD等多种病理过程中的氧化应激状态变化与PRDX2表达及相关通路存在联系,如PRDX2可经PI3K/AKT通路参与调控肿瘤发展以及治疗中的氧化应激过程，又比如其可以通过Wnt/β-catenin信号通路调控结肠癌细胞的氧化应激状态以及通过调控一些微小RNA来影响肿瘤的氧化应激状态等[28-30]。本研究体内外实验结果显示，与相应对照组相比，DKD小鼠模型组肾脏中和人肾小球系膜细胞高糖刺激模型组细胞中均存在PRDX2蛋白表达水平明显下调，但经TP干预处理后，与模型组相比，PRDX2蛋白表达量被明显增加，说明TP处理能够上调PRDX2表达，从而增强细胞抵抗高氧化应激状态的能力，有利于维持肾脏组织细胞内正常的氧化还原状态。

因此，本研究通过体内外实验结果推测TP很可能可以通过上调肾脏组织中PRDX2的蛋白表达水平来抑制了组织细胞中的氧化应激状态，从而减轻DKD的肾脏损伤程度。本研究探讨了TP通过上调PRDX2改善肾小球系膜细胞氧化应激状态的分子机制，为TP的进一步临床应用提供了实验室依据。但本研究在实验设计方面尚存在不足之处，若能够在TP作用人肾小球系膜细胞中下调PRDX2的蛋白表达水平，观察在PRDX2表达被下调的情况下，TP是否失去了抑制氧化应激状态的能力，将会增加本研究结果的说服力。但本研究也提供了未来深入探讨TP用于治疗DKD及其他疾病的药理作用及其分子机制的研究方向。