马晓霞 ，孙 旸 ，马 瑞 ，崔志坤 ，王 越 ，郭小芹 ，邓为民

（1.天津医科大学免疫学系，天津300070；2.武警后勤学院病原生物学教研室，天津300309；3.武警特色医学中心妇产科，天津300163）

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，病发隐匿，大部分患者确诊时已属晚期，因此卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的恶性肿瘤。作为雌激素依赖性肿瘤，雌激素与雌激素受体（estrogen receptor，ER）的相互作用可促进其发生发展[1-3]。他莫西芬（tamoxifen，TAM）是目前临床上治疗乳腺癌最具代表性的抗雌激素药物，卵巢癌与乳腺癌虽然同为雌激素依赖性肿瘤，但二者对抗雌激素治疗反应不同。约2/3 ERα阳性的乳腺癌患者对TAM治疗有效，而卵巢癌患者有40%～60%表达ERα，但仅有7%～18%的患者对抗雌激素治疗有效，因此，探讨卵巢癌在抗雌激素治疗中发生耐药的机制具有重要意义[4]。IL-6是由多种细胞产生的一种炎症性细胞因子，临床资料显示，卵巢癌患者IL-6的高表达与不良预后及化疗敏感性差密切相关[5-6]。本课题组研究发现，卵巢癌细胞自分泌IL-6的水平与其对TAM的敏感性呈负相关。不分泌IL-6的A2780细胞对TAM敏感；而高分泌IL-6的CAOV3细胞对TAM耐药[7]。IL-6是否影响卵巢癌细胞对TAM的敏感性？本研究对内源性及外源性IL-6在诱导卵巢癌抗雌激素治疗耐药中的作用进行初步研究，从而为解决卵巢癌内分泌治疗耐药这一难题提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司产品；噻唑蓝（thiazolyblue，MTT）：Sigma公司产品。美国GIBCO公司产品：RPMI/1640培养基、活性碳处理的FBS（sFBS）；中美合资兰州民海生物工程有限公司产品：胎牛血清（FBS）；美国R&D公司：重组人IL-6、人IL-6 ELISA试剂盒；美国Invitrogen公司产品：LipofectamineTM2000、G418；TaKaRa 产品：M-MLV（RNase H-）逆转录酶、2×Premix Taq；100bp DNALadderMarker产自天根生化科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞系和细胞培养 人卵巢腺癌细胞（A2780）和人乳突状卵巢腺癌细胞（CAOV3）均为美国ATCC公司产物，前者购自南京凯基生物科技发展有限公司，后者为本室保留。前者用含有10% FBS的RPMI-1640培养液培养，后者用含10% FBS的DMEM培养液培养，该培养液含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

1.2.2 基因转染克隆的筛选与鉴定 A2780细胞不分泌IL-6但表达其受体，而CAOV3细胞高表达IL-6及其受体。前期工作[7]获得中度和高度表达IL-6的2个A2780细胞克隆（A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H）及A2780/pcDNA3.1+。本研究将带有反义IL-6 cDNA的表达载体pcDNA3.1+/asIL-6转染至CAOV3细胞中，细胞转染48 h后，应用G418（浓度为600 μg/mL）进行加压筛选获得的阳性转染细胞克隆经扩大培养后分别收取培养上清和细胞进行ELISA和RT-PCR鉴定，获得IL-6中度和高度抑制表达的2个CAOV3细胞克隆（CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi）。同时将空载体转染至CAOV3细胞作为阴性对照，为CAOV3/pcDNA3.1+。

1.2.3 IL-6的ELISA检测 取对数生长期的上述卵巢癌细胞，调整各种细胞浓度为1×105/mL，接种于12孔细胞培养板中，1 mL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培养48 h后，收集培养上清，按照ELISA试剂盒的说明书检测培养上清中IL-6的含量。

1.2.4 RT-PCR反应 总RNA的提取的流程参照TRizol试剂（美国Invitrogen）说明书。逆转录反应条件参照M-MLV逆转录酶说明书进行，引物序列IL-6 如 下 ：IL-6:forward 5′-TTGACAAACAAA TTCGGTACA-3′，reverse 5′-GAGGTGCCCATGC T ACA-3′（497 bp）；β -actin:sense5′-TGGAATCCT GTGGCATCCATGAAAC-3′，antisense 5′-TAAAACG CAGCTCAGTAACAGTCC-3′（350 bp）。PCR反应体系：cDNA 1.0 μL，2×PremixTaq 10 μL，上、下游引物各10 pmol，加双蒸水至总体积20 μL。PCR反应的程序如下：预变性，94 ℃ 5 min；变性，94 ℃ 30 s；退火，59℃45 s；延伸，72℃1 min，设定34个循环。反应终止时，吸取5 μL PCR反应液在浓度为12 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳。结果使用Quantity One软件（Bio-Rad公司）分析，内参是β-actin，使用靶基因/β-actin的光密度比值对mRNA进行相对定量。

1.2.5 MTT试验检测细胞活性 应用终浓度50ng/mL IL-6作用于A2780细胞，连续处理10 d，期间每2 d更换1次新鲜的培养液并加入相同浓度的IL-6，经上述处理的细胞命名为IL-6预处理的A2780细胞（A2780/preIL-6细胞）。将A2780/preIL-6，A2780细胞分别接种到 96 孔板中（4×104/mL），100 μL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培养24 h后弃去培养液，更换含有50 mL/L FBS的培养液，A2780/preIL-6细胞先加入20 μL终浓度为50 ng/mL的IL-6，然后与A2780细胞一起分别加入不同浓度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L），30 min后加入雌二醇（E2终浓度为1 nmol/L）。每个浓度设5个平行孔，并以TAM的稀释液乙醇作为对照。37℃、50 mL/L CO2孵箱中培养48 h后，在结束培养前4 h离心弃上清后加入 MTT 溶液(0.5 g/L，PBS配制)，于 37℃、50 mL/L CO2孵箱内继续培养4 h，离心弃MTT溶液后加入DMSO 100 μL/孔，充分振荡至细胞内的紫蓝色结晶完全溶解，置酶标仪上测定波长为490 nm时的吸光度（A）值。同时，内源性过表达IL-6的A2780/ssIL-6及抑表达IL-6的CAOV3/asIL-6细胞，同样采取上述方法检测其细胞活性。

1.3 统计学处理 统计学分析使用SPSS17.0软件包进行统计学分析，最终结果以±s表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LDS法，P＜0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 asIL-6基因转染卵巢癌细胞克隆筛选的鉴定 由图1a可见，与空载体转染细胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，IL-6中、高抑制表达的2个CAOV3细胞克隆，其IL-6分泌水平分别下降了63.82%和75.69%（P＜0.01），命名为 CAOV3/asIL-6Mi和 CAOV3/asIL-6Hi细胞，而未转染细胞CAOV3与空载体转染细胞CAOV3/pc DNA3.1+相比IL-6分泌水平无明显差异。上述稳定转染细胞克隆的IL-6 mRNA水平与其分泌水平相一致（图1b）。

图1 asIL-6基因转染CAOV3细胞克隆的IL-6表达水平Fig 1 ThelevelofIL-6expressioninasIL-6-transfectedCAOV3cell

2.2 外源IL-6可以诱导A2780细胞对TAM产生耐药 由图2可见，经不同浓度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L）作用后，A2780/preIL-6 细胞增殖水平均显著高于A2780细胞（均P＜0.05）。说明外源性IL-6可以诱导A2780细胞对TAM产生耐药。

图2 外源性IL-6影响A2780细胞对他莫西芬的敏感性（MTT法）Fig 2 MTT assay for the effect of exogenous IL-6 on the sensitivity of A2780 cells to tasmoxifen

2.3 内源性IL-6影响卵巢癌细胞对TAM的敏感性 如图3a所示，经不同浓度TAM作用后，A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H细胞的增殖水平均较空载体转染细胞A2780/pcDNA3.1+明显增加（均P＜0.05），与未转染细胞A2780和空载体转染细胞A2780/pcDNA3.1+比较，细胞增殖水平无明显差异。表明内源性过表达IL-6可诱导A2780细胞对TAM产生耐药。而抑制内源性IL-6表达可恢复CAOV3细胞对TAM的敏感性，如图3b所示，与空载体转染细胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi细胞增殖水平均显著下降（均P＜0.05）。未转染细胞CAOV3和空载体转染细胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，细胞增殖水平无明显差异。上述结果提示IL-6可诱导卵巢癌细胞对TAM产生耐药。

图3 内源性IL-6影响卵巢癌细胞对他莫西芬的敏感性（MTT法)Fig 3 MTT assay for the effect of endogenous IL-6 on the responsiveness of ovarian cancer cells to tamoxifen

3 讨论

卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌列居妇科恶性肿瘤第3位，而病死率在女性生殖系统癌症中高居首位。作为一种雌激素依赖性肿瘤，流行病学表明雌激素替代治疗可增加卵巢癌的发病风险；与正常绝经后妇女相比，绝经后卵巢癌患者血清中雌激素水平更高。一直以来，他莫西芬是卵巢癌抗雌激素治疗的首选药物。抗雌激素药物可作为配体竞争性地与ER结合，通过诱导ER构象改变而使ER的DNA结合区不能与靶基因上的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）结合，由此阻断了雌激素的转录激活效应。但根据受体状态进行内分泌治疗的效果不佳[8-10]，具体机制尚不清楚。

IL-6是一种多功能细胞因子，其与多种肿瘤的发生、发展关系密切。IL-6通过影响细胞的粘附性和活动力、血栓形成、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增殖而影响肿瘤的发生和发展。临床资料表明卵巢癌患者高表达IL-6，其腹水中的水平明显高于血清，IL-6水平升高与卵巢癌的不良预后及化疗敏感性差相关[5]。体外实验证明IL-6可增加卵巢癌细胞的粘附性、趋化性及总侵袭力；卵巢癌细胞产生的IL-6是一种潜在的前血管生成因子；并可通过促进MMP-9分泌而提高其致瘤性[6,11]。目前，国内外对IL-6在雄激素依赖性肿瘤前列腺癌细胞生长和抗雄激素治疗中作用及相关机制的研究相对较多。对IL-6在雌激素依赖性肿瘤乳腺癌和卵巢癌细胞生长中的作用报道较少，如有研究表明IL-6对乳腺癌细胞生长有抑制作用[12]，但对其转移却有促进作用；研究发现IL-6不仅可促进卵巢癌细胞生长，同时还证明雌激素对卵巢癌细胞的促生长作用有部分是由IL-6介导的[13-14]。

本课题组前期研究发现，人卵巢癌细胞自分泌IL-6水平与其对TAM的敏感性呈负相关，提示IL-6可能在卵巢癌内分泌治疗耐药中发挥作用。本研究利用内源性和外源性IL-6处理的卵巢癌细胞作为模型，观察IL-6在卵巢癌细胞对TAM敏感性中的作用。结果表明，外源性IL-6和内源性过表达IL-6均可明显促进卵巢癌细胞的增殖水平，提示IL-6可诱导卵巢癌细胞对TAM产生耐药，而抑制内源性IL-6表达则明显降低卵巢癌细胞的增殖水平，表明抑制IL-6表达可恢复卵巢癌细胞对TAM的敏感性。

本研究从正反两方面证实IL-6可诱导卵巢癌细胞对TAM产生耐药，对IL-6在诱导卵巢癌细胞对TAM产生耐药中的作用进行初步探讨，不仅有助于帮助笔者预测治疗的疗效，而且有望为逆转卵巢癌抗雌激素治疗耐药提供新的靶点。然而IL-6诱导卵巢癌细胞抗雌激素治疗产生耐药的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。