杨官品, 孙诗阳, 潘克厚, 郭 栗

(中国海洋大学 1. 海洋生命学院； 2. 海洋生物遗传育种教育部重点实验室； 3. 进化与海洋生物多样性研究所； 4. 水产学院，山东 青岛 266003)

转录(Transcription)是中心法则(Central dogma)概括的基因表达的第一个关键步骤。细胞基因转录本集合反映细胞生理状态, 是“基因组-转录组-蛋白组-性状”链条的第二个环节, 是生物基因型-表现型的中间桥梁之一。尽管离生物表型还隔着蛋白组, 但转录组在数据获取、参考数据丰富度和数据解读方面较蛋白组有极显著的方便性。随着设备的更新和软件工具和试剂的升级换代, 转录组分析成本越来越低。从RNA印迹杂交(Northern blotting hybridization)、实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)、基因芯片(Microchip或microarray)到现在普及的全转录组鸟枪法测序(Whole transcriptome shotgun sequencing, RNA-seq), 获取基因转录本丰度信息的效率越来越高。目前, RNA-seq主要用二代测序技术(但四代纳米孔测序也能做到定量转录本丰度), 依赖但不绝对依赖参考基因组或全长转录组数据[1]。

通常熟悉的RNA-seq, 一般都是单一物种或单一细胞类型在不同时间和空间序列点上的分析, 通过与对照比较, 获取转录本丰度显著差异的基因，即差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs), 解析不同发育时期和环境(不同时空条件)下生理学变化过程和生理学机制, 很少见在多物种或多细胞类型分隔或混合培养状态下、或对天然生物群落进行转录组分析。但自然界不同物种之间广泛存在相互作用, 且多以物种混合状态出现，这也对传统的RNA-seq提出了一定挑战。

本文从两物种(或细胞类型)的交互转录组分析(Dual RNA-seq)到多物种(或细胞类型)混合物种转录组分析(Mixed-species RNA-seq)介绍了转录组分析从单物种单细胞类型向混合物种、多细胞类型的发展趋势, 以期为海洋生态学研究提供参考。

1 RNA-seq定量基因转录本丰度

确定细胞在不同生长阶段和环境条件下的基因表达模式变化, 目前使用最广泛的技术是转录组随机测序(Whole transcriptome shotgun sequencing, RNA-seq)。RNA-seq是一种利用海量平行测序方法对转录组进行分析的技术, 可分析低丰度转录本, 容忍无参考基因组序列的分析, 相对微阵列杂交(Microarray hybridization)等, RNA-seq的转录本覆盖度和分辨率更高, 价格更低, 已成为研究基因表达模式、代谢过程、生理机制等的首选技术。RNA-seq主要用二代测序平台获取和比较一个物种不同发育时期或不同生长条件或不同器官组织全部基因转录本丰度[2-3]。但转录组分析不限于二代测序技术。目前, 纳米孔测序(因为直接基于DNA分子结构进行测序, 可理解成人眼通过仪器延伸直接阅读DNA序列, 作者称之为第四代海量平行测序技术)不仅可以获得全部转录本的全长序列, 而且可以实现定量, 也就是同步获得转录本丰度信息。

转录组测序有无参和有参两种选择。无参指没有参考基因组序列, 不依赖已知基因列表, 先在二代测序平台上获得短读序(Read), 然后从头组装成连续序列, 或称Unigene, 就是对应不同转录本(包括转录后可变剪切产物)的也有可能是不完整的 cDNA序列。Unigene数量经常远远超过依据基因组序列预测的基因(Gene model)数量。转录组测序同时获取转录本丰度(Abundance)信息。这样的丰度信息经过正规化(主要是转录本长度差异)修正后, 同物种不同生长或发育时期、不同器官组织、不同环境、不同处理间可以相互比较, 提取丰度差异, 进一步根据功能分组或富集到不同的代谢途径或信号通路, 辅助阐明生理学过程或生理机制。

随着测序技术的不断进步, 现在的纳米孔测序, 不仅能获得全长转录本序列, 而且能做到转录本丰度定量。只是成本比二代测序高一些。与无参转录组测序同时存在的, 还有有参转录组测序, 也就是二代获得短reads之后, 不是从头组装, 而是根据序列同源性堆砌(Align/ map)到基于高质量参考基因组序列预测的基因(Gene model)上, 再根据基因长度修正, 获得不同基因的转录本丰度信息。有参转录组分析需要高质量的参考基因组序列, 可以分析基因的可变剪切(Alternative splicing)等情况。遗憾的是, 很多非模式物种暂时没有高质量参考基因组序列, 无法实现有参转录组分析。为在成本和探索需求间取得平衡, 作为替换手段之一, 可以先做全长转录组测序[4-7], 用全长转录本序列做参考, 再用二代测序进行转录组分析。尽管全长转录组测序可以混合生长发育时期、不同器官组织、不同处理条件的样品, 尽可能多的覆盖转录本序列, 但总有可能产生遗漏。用四代纳米孔测序(因为连DNA聚合酶都不需要了, 作者称其为四代测序, 以期与三代实时单分子测序区别)可以做到转录本丰度定量。这时候就无法顾及转录本类型覆盖度了。目前, 一般的策略是依据参考基因组信息或全长转录组信息, 基于二代测序技术, 进行转录组测序分析。另外, 目前还有单细胞基因组(Single-cell genome sequencing)和转录组测序(Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)[8-10]。尽管有基于微阵列(Microarray)和混合RNA测序(Bulk RNA-seq)的细胞群体转录组分析[11-12], 但从物种角度看, 这些分析或分析手段都是单一物种的比较分析。

作为一种发展趋势, RNA-seq越来越多地用在多物种或多细胞类型的转录组测序分析上。表现在三个方面：(1)数据再分析。在这种情况下, 独立分开获得的数据被综合再分析, 提炼出原分析无法提炼的认知[13-15]；(2)双物种或细胞类型RNA-seq(Dual RNA-seq)；(3)多物种或细胞类型RNA-seq。这些都是研究物种间或细胞类型间互作的方法, 互作可以分为直接互作和间接互作。直接互作就是物种或细胞类型间可以接触, 而间接互作就是物种或细胞类型是物理分隔培养的, 但共享培养环境。

2 共用培养环境的不同物种或细胞的分隔培养

共享培养环境(如培养基)的不同物种或不同细胞分隔培养可研究数量有限的物种或细胞类型间的相互作用[16]。不同物种或细胞类型的物理分隔可借助微流体系统(Microfluidic system)、膜(Membrane)、微液滴(Droplet)、培养皿(Petri dish system)、固体支持系统(Solid support system)、凝胶(Gel)、玻璃夹层(Glass slide)、分区生物反应器(Bioreactor system)、互通微池(Transwell system), 等[17]。不同物种或细胞类型与培养基之间可物理分隔, 但培养环境可共享, 培养基内物质可自由交流, 为所有物种或细胞类型共用, 但不能保证共享共用的效率一致。因材料和/或物质交流空间位阻限制, 可分隔培养的物种数或细胞类型数是极其有限的[18]。Thermo Scientific公司甚至专门设计了适用不同细胞类型分隔培养的插管和载板(Nunc cell culture inserts and carrier plates)。有了这样的培养体系, 物种间或细胞间的互作就能发生并能被检测到。不同物种或细胞类型的共培养分直接(Direct)共培养和间接(Indirect)共培养[19]。现在的趋势是增加直接共培养的物种数或细胞类型数, 基于数据处理实现物种或细胞类型分隔, 而不是物种和细胞类型的物理分隔。随着测序技术的进步, 物种或细胞的物理分隔培养现在已经越来越少了。

3 两物种或细胞类型混合转录组分析(交互转录组分析, dual RNA-seq)

物种在自然界中从来都不是彻底独立存在的。稳定生态系统存在诸多物种, 物种间存在复杂相互作用。仅考虑两物种间相互作用, 基于利害就可以将两物种间相互作用分为竞争(对双方均有害)、互利共生(对双方均有利)、偏利共生(对一方有利, 对另一方无影响)和寄生(对一方有利, 对另一方有害)等四类。物种间相互作用往往表现在生理生化层面, 有时也表现在基因层面。例如, 相互作用一方的分泌物或其本身被另一方细胞表面受体识别, 引发另一方的信号传递级联反应, 触发或停止转录调节因子, 改变相关基因转录本丰度, 进而改变其行为和代谢过程[1]。用交互转录组测序研究的重要生物学问题包括：病原-宿主侵染关系、寄生关系和互利共生关系等。病毒、细菌、真菌、原生动物等都可作为病原侵染真核生物细胞, 侵染过程影响双方的基因表达模式和生理生化过程。互作转录组可同时监测双方分子水平的交互变化[20]。该方法最早用于细菌感染人体的研究中。例如：在白色念珠球菌(Candidaalbicans)侵染人体肌肉细胞, 互作转录组分析甄别出存在关联变化的基因调控模式[21]。

交互转录组分析用于寄生关系研究, 涉及的物种组合包括真菌-植物、真菌-动物、细菌-动物、寄生虫-动、病毒-植物、病毒-动物等(见表1)。寄生关系往往发生在两个亲缘关系差异巨大的物种之间, 它们的细胞结构、翻译过程中RNA的含量和组成迥然不同。作为宿主的真核细胞每个含有10～20 pg的RNA, 这大致是单个细菌细胞含量的100～200倍。但在真正感染过程中, 一个真核细胞往往有可能被十倍于其细胞数目的不同种类的病原侵入, 这也可将双方RNA含量的差距缩小到10～20倍。除此之外, 真核细胞所含有的snRNA、snoRNA、scaRNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA、lincRNA和mRNA共同占了RNA总量的5%, 而细菌细胞的mRNA则独占了其总量的5%[20]。基于这些特点, 在提取RNA时为了做到能兼顾二者的提取效率, 在普遍用TRlzol作为抽提溶剂的基础上还可选择均质仪、玻璃珠或利用相关溶解酶、缓冲液、超声(革兰氏阳性细菌适用)来增强病原体一方的破壁效果[38], 并结合MICROBEnrich试剂盒或Poly(A) Purist Mag方法来富集其转录丰度[39]。其次, 在比对时可根据实际情况选择将二者的参考基因组分开还是整合到一个文件内进行比对, 并根据其各自的差异特点设置合适的比对参数, 交叉匹配的序列情况可以作为比对质量的参考[40]。在实施时, 细菌真核细胞混合所测序列可首先利用HISAT2、MapSplice、STAR、Tophat2中的一种软件来分离隶属于真核宿主细胞的序列, 然后再将余下的序列通过Bowtie2、SEAL、SOAP2软件中的一种进行属于细菌序列的识别[38,41]。还可使用RNA CoMPASS这样一款近年发明的对用户友好的算法平台来进行全过程的比对[42]。Dual RNA-seq在寄生领域将会被应用到探讨宿主与更多种类病原体共存关系的情况中。根据实验目的和要求的不同还可与Single cell RNA-seq结合来解决被感染宿主细胞所占比例少, 同一组织样本中细胞类型不同、感染阶段不同步等传统RNA-seq所遗留的问题[39]。研究人员在沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)感染小鼠巨噬细胞的实验中就首次采用了这种手段从而提出了一个包含3个阶段的感染过程模型[43]。

表1 用交互转录组分析方法研究过的部分种及寄生关系信息

自然生态系统中也普遍存在互利共生关系。目前, 人们用dual RNA-seq阐明或丰富了这些物种之间长期自然选择形成的共生策略, 共生机制涉及物质交换、环境资源分工利用等。最早尝试使用dual RNA-seq进行共生关系研究的是两种同属细菌,Treponemaprimitia和T.azotonutricium。它们是白蚁肠道菌群中的两种细菌, 将白蚁摄入的木质纤维素分解为二氧化碳、醋酸、氨基酸、维生素等一系列生存必需物质。已知这两种细菌之一给另一种提供氢气。交互转录组分析发现双方在维生素B6、B7及一种辅酶A的合成利用上也存在合作[44]。小麦和根瘤固氮菌是典型的互利共生关系。一种固氮菌(Azospirillumbrasilense)和小麦(Triticumaestivum)的dual RNA-seq发现固氮菌促进小麦生长的机理。一种类似NarL的蛋白使固氮菌吸附到小麦根部, 固氮菌上调硝酸盐及一些营养物质转运体基因的表达, 同时提高小麦根部细胞DNA复制及细胞分裂能力, 促进小麦根发育。另外, 固氮菌下调乙烯及类黄酮物质合成有关基因的表达, 提高小麦抵抗环境胁迫的能力[45]。有一种罕见的蝾螈(Ambystomamaculatum), 其受精卵细胞和一种绿藻(Oophilaamblystomatis)共生。绿藻吸收受精卵内丰富的磷酸盐和谷氨酰胺, 同时为受精卵提供氧气、有机酸、脂肪酸等, 影响受精卵运输外界营养物质, 降低胞内糖分消耗[46]。

4 混合物种转录组分析(Mixed-species RNA-seq, msRNA-seq)

生态系统中物种互作涉及众多物种, 十分复杂[47]。为用转录组测序方法研究多物种相互作用, 人们提出了混合物种转录组测序(Mixed-species RNA-seq)策略[48]。共培养(Co-culture)或共存不同物种(包括不同细胞类型)混合转录组测序不需要物种隔离。它用数据处理方式将混合数据分配给不同物种, 实现信息层面的物种分离(insilicoRNA-seq read sorting)。能做到信息层面物种分离是因为mRNA的进化趋异(Evolutionary divergence), 也就是进化过程中产生的基因有无和基因序列差异等变化。作为例子, 该方法已用在人初级星形胶质细胞(Human primary astrocyte-鼠胚胎(Mouse embryo)-仓鼠幼崽(Rat pup)体细胞[48]、人-鼠心肌神经元细胞(Cortical neuron)[49-50]、人-鼠血小板细胞(Platelet)[51]的混合转录组测序上。医学研究方法总是走在前面的, 混合物种转录组测序也不例外。除了不同细胞类型, 该方法也开始用于被子植物[52]和藻[53]等生物类型的混合物种转录组分析上。作者相信, 混合物种转录组测序完全可以克服不同物种分离或物理分隔的方法限制和不利因素, 实现从数据角度剖分物种, 一定能用于海洋生态学和实验海洋生态学研究, 剖析物种间的互作关系, 廓清众多海洋生态学的关键问题。混合物种转录组测序(mixed-species RNA sequencing, msRNA-seq)一定能在海洋生态学研究中发挥其独特作用。

混合物种转录组测序方法的形成不是一蹴而就的。测序技术的进步为该方法提供了存在的条件。两物种交互转录组测序(Dual RNA-seq)是该方法的最约减形式, 在宿主-病原菌互作机制等研究上已发挥了重要作用。RNA-seq一般分析单一物种的转录本。当分析两物种或多物种的转录本及其丰度变化时, 传统的RNA-seq就不得不在提取RNA前就将这些物种分离。对那些能分离的物种, 需要前期工作, 也必然会带来污染或基因表达变化等影响。更多的情况是物种无法分离。交互转录组(dual RNA-seq)在数据处理阶段拆分物种, 很好地解决了这些问题[2]。

msRNA-seq形成的读序来源两种或两种以上的物种或细胞类型。Hasel[50]研发了一个搜寻和分配程序(Sargasso: Sargasso Assigns Reads to Genomes According to Species-Specific Origin)(http://doi.org/10.5281/zenodo.206619)，依据物种或细胞类型搜寻和分配读序将读序分配到不同的物种或细胞类型。目前，转录组测序多走商业测序途径。不论使用什么工具进行分析，分析的策略都应该是先依据同源序列在不同物种或不同物种细胞之间的进化趋异特点将读序先分配到不同的物种或细胞类型中，然后与对照比较转录组差异，解析生理学机制。这样做，可以克服因细胞比例不同而导致的基因转录本丰度过低的问题。不论细胞比率，转录组分析获得的读序数量都应该满足饱和程度的要求。研发这一工具的时候，用的只是两类细胞。但随着拟研究问题越来越深入，需要做msRNA-seq的物种或细胞类型越来越多。为此，Qiu[48]专门写就了一个msRNA-seq的标准实验程序。

5 msRNA-seq在海洋生态学中的应用前景

5.1 有害藻类过度繁盛及群落演替机制研究

有害藻类过度繁盛(Harmful algal blooms, HABs)发生频率不断增加, 其环境影响越来越严重, 已成为海洋主要生态问题之一。在自然生态环境中，硅藻和甲藻间存在强烈竞争[54]。硅/甲藻指数(Diatom/Dinoflagellate index)经常用来指示环境变化[55]，如气候变暖等[56]。硅藻和甲藻用不同的机制响应环境变化[57]。硅藻和甲藻的竞争还表现在形态、生理甚至分子层面[58]。中国长江口海域2000年以前主要是硅藻(如Skeletonemacostatum)引起HAB[59]。之后, 甲藻(如Prorocentrumdonghaiense、Kareniamikimotoi)等逐渐取代硅藻成为引起HAB的主要藻类。目前,硅藻-甲藻演替机制研究主要围绕环境因子(如营养盐、温度、光照、甲藻有毒化感物质等), 而在转录组层面研究硅-甲藻竞争机制很少。仅有的报道也是先混合培养，然后分隔两物种藻种细胞再做RNA-seq，解析硅-甲藻互作生理机制[58]。在数据处理过程中而不是在培养阶段分隔硅藻甲藻，解析它们互作分子机制时，不得不面对的主要问题是具有参考基因组序列同时也是海洋环境(或拟研究；或被关注)过程关键参与者的物种很少。到目前为止，有基因组序列的只有三角褐指藻[60]和海链藻[61]，而具有基因组序列的甲藻只有珊瑚共生甲藻[62-63]。这些共生甲藻基因组能被测序，最主要原因是它们的基因组较小(1 Gb左右)。与此形成鲜明对照，一些自由生活甲藻的基因组十分巨大，最多接近200 Gb。用现有技术测定这些甲藻的基因组序列仍然是巨大的挑战。当然，这些巨大基因组可能存在暂时还没有被理解的特殊结构，也许通过适当的人工调整，这些基因组也能很快被测定。但是，至少到目前为止，甲藻参考基因组序列缺乏对用msRNA-seq解析硅-甲藻互作机理还是一个限制。克服的方法也是有的，比如全长转录组分析获得的转录本序列就能用作msRNA-seq的参考基因序列。

在技术方面，目前已经有方法将特定藻或动物细胞从群体中分离出来，再结合单细胞组学分析方法，可以研究不同物种(或细胞类型)互作机制。作为例子，单细胞分选方法有基于核酸适配体的微流体装置(Aptamer-based microfluidic device)[65]、荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)[66]、拉曼激活细胞分选(Raman-activated cell sorting, RACS)[67]、拉曼激活细胞分选和测序(Raman-activated cell sorting and sequencing, RACS-SEQ)(https://phys.org/news/2018-11-china-world-instrument-raman-activated-cell.html)等。值得称道的是，中国科学家在这个领域已经领跑世界，RACS、RACS-SEQ设备和技术就是中国科学家研发的。虽然细胞分选技术、单细胞分选和单细胞测序技术组合有望解析不同藻类或不同细胞类型的互作机制。物种的表现型是众多细胞的集体的表现型，了解单细胞表现型的同时，无法描述物种群体的表现型。因此，单细胞分选和测序技术形成了一个技术极端。现代方法和技术能用于探索新问题，但如何与传统认知融合尚待深入探索。

中国科学家还在探索另一个方法学极端，就是直接针对浮游植物群体做组学分析，解析硅藻-甲藻在自然群体中的演替规律，即所谓宏组学(Metaomics)研究。例如，Zhang[68]进行天然浮游植物集合时间序列宏转录组分析(Time sequential metatranscriptomic profiling)，测定宏转录组，解析群体生理学过程演变，通过将硅需求、尿素信号途径归于硅藻而将磷需求、细胞自噬营养循环等归于甲藻，基于群体生理学过程演变解析硅藻-甲藻演替机制。这是另一个技术极端，虽然回避了单细胞分选，但也无法精确到物种进行机制解析。更极端的探索是直接进行蛋白组分析来解析细菌-甲藻在HAB过程中互作机制[69]。同样，这样的尝试无法基于具体物种解析机制。作者有理由相信, 混合物种RNA-seq将能结合不同方法的优势，克服不同方法的限制，给硅藻-甲藻竞争机制和环境中各种复杂互作机制研究带来新的生机和活力。

5.2 微藻规模化养殖效益和敌害生物控制研究

不同物种互作研究是合成生态学(Synthetic ecology)研究内容之一, 即人为构建多物种共培养系统或直接针对自然群体, 阐明不同物种间的相互作用、提高特定物种培养效率或建立物种间新型互作关系[17], 在医学、工业生产、环境等方面有广阔的应用前景。农作物中，不同水稻品种规模化分块混合栽培可以有效防止病虫害。可以预期的是适当组合的微藻、微藻-细菌混合养殖甚至适当的微藻与浮游动物组合有可能提高微藻养殖效率。例如，产油微藻的室内生长和油脂合成条件不适用规模工业化生产, 而室外单微藻种养殖经常受敌害生物(原生动物、杂藻、细菌等微生物)影响。基于细致的研究, 人为构建产油微藻的合成群落(Synthetic community), 让目标藻、共生菌、伴生生物营养互补, 抑制敌害生物繁殖, 就可以提高产油微藻培养效率, 促进产油微藻大规模养殖[70]。

5.3 与珊瑚礁白化现象有关的藻-珊瑚虫共生机制研究

拥有着广泛生物多样性和较高初级生产力的珊瑚礁生态系统是整个海洋生态系统的一个极为重要的组成部分。而造礁的珊瑚虫对自身的生存环境要求极为严格：盐度、温度和营养物质等因素都必须要稳定在一个特定的范围内。当周平均温度的浮动范围在超过一度后，就会破坏其与胞内虫黄藻的互利共生关系，造成珊瑚礁的“白化”现象[71]。因此，揭示虫黄藻属与珊瑚虫的共生及其对外界环境的响应机制是解决近些年来世界范围内珊瑚礁大规模白化现象爆发的关键。

运用Dual RNA-seq的思想，有日本研究学者对从冲绳附近海域采集到的一种珊瑚虫(Acroporatenuis)及可附生在其上并进行良好繁殖的虫黄藻属中的一种Symbiodiniumtrenchi的早期共生建立过程进行了分子水平上的初步探索。结果显示，虫黄藻在入侵过程中其自身的miRNA出现了过表达的趋势，而珊瑚虫细胞内与胞吞作用有关的基因也相应呈现上调状态，与之相反的是与免疫作用及消化酶有关的基因则处于下调状态。并且，两者还在糖类、谷氨酸等相关蛋白质的代谢及缩醛磷脂的合成方面有密切联系[72]。

5.4 海洋生态系统中重要的寄生关系研究

如前文表格中所示的病毒、真菌、细菌、原生动物等寄生类群在海洋生态系统中也发挥着重要的作用。有研究对太平洋三个河口营寄生和自由生活的动物类群的生物量和生产力进行了定量分析发现寄生动物类群的生物量甚至超过了处于食物链顶级的肉食动物。它们可以通过影响中间宿主的行为来选择性的促进捕食者与被捕食者的关系并通过食物链的传递来作用于整个食物网的拓扑结构[73]。海洋生态系统中的寄生关系主要应用于利用寄生动物作为生物标记来判断不同经济鱼群以及作为病原体所引发的海水养殖品种的病害防治方面[74]。而对于后者，尤以病毒成为一个日益活跃的成病原因。养殖品种疾病爆发原因复杂，同一寄主在宿主的幼体期及成体期也有着不同的表现情况[75]，这其中还有太多未识别的病原种类及寄生作用机制亟待msRNA-seq的加入来填补研究空白。用一句话概括，只要是涉及物种间相互作用机制的研究都可以使用msRNA-seq方法。

6 结语

转录组测序只是一种手段。已普遍的二代测序、正在推广的四代纳米孔测序是工具和技术的推陈出新, 标志成本的快速降低和效率的不断提高, 但如何应用这种手段来解决海洋生态学领域多种多样的复杂棘手问题还需要研究设计的创新。交互转录组(Dual RNA-seq)、混合物种转录组(Mixed species RNA-seq)、单细胞转录组(Single cell RNA-seq)[76]及显微镜下可观测的细胞转录组(空间转录组)(Spatial transcriptomics)[77]等提供了越来越多、越来越灵敏的转录组分析手段, 利用好这些手段, 解决好海洋生态学问题是海洋生态学研究者需要积极探索的研究领域。研究手段现代化和研究思路新颖化必将为海洋生态学研究提供新的生机与活力。

单细胞测序(Single cell sequencing)基于海量平行测序(即所谓下一代测序)获取单个细胞的序列信息，分单细胞基因组测序和单细胞转录组测序，为更好地解析细胞间差异、更彻底地理解处于微环境中不同细胞的功能提供了可能[78-79]。单细胞基因组测序包括单细胞分离、全基因组扩增、测序文库构建、基于海量平行测序技术测序等步骤。以这样的方式获得的基因组一般称为单细胞扩增基因组(Single amplified genome, SAG)。单细胞转录组测序包括单细胞分离、裂解、逆转录、cDNA扩增和用RNA-seq定量转录本丰度等步骤。在结语中重提单细胞测序，有两个原因：(1)尽管目前存在各种技术挑战，单细胞测序基于单细胞基因组和转录组信息解析群体中不同细胞的变异和生理状态；(2)为不同物种提供参考基因组或转录本参考序列。单细胞测序技术具有认知单个细胞遗传变异和生理行为的潜力，但物种总是表现为细胞(个体)的群体行为，物种竞争和互作是细胞群体间的竞争和互作。当数据量足够大(饱和)的时，只要将数据分配到不同的物种或不同物种的细胞，就能解析细胞群体表现进而理解物种互作和竞争。单细胞测序是现在的研究热点，但它面临各种技术挑战。用该技术获得所有物种参考序列可行性仍然不高。例如，甲藻基因组大小变化巨大， 有些甲藻基因组达200 Gb左右。目前基于细胞群体的基因组测序技术尚且拿这么大的基因组没办法，何况单细胞测序技术。因此，在相当长的时间里，仍将不得不在实验生态系统中用msRNA-seq研究有基因组或者全长转录组序列的物种间的互作和竞争机制。

另外，生理学机制也包括次生代谢产物合成的变化和次生代谢物质在细胞间的转运、识别和响应[80]。尽管这些变化可以在转录组层面反映出来，但细胞内、细胞外的代谢物组成和变化分析是深入认知物种互作和竞争的重要信息。在生理学层面解析物种互作和竞争机制的同时，理应分析细胞内外次生代谢物质的组成和动态变化。