魏忠伟 郑配国 李付广#

（1 郑州大学基础医学院 河南郑州 450001；2 郑州大学第一附属医院检验科 河南郑州 450052）

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG）是髓鞘膜和少突胶质细胞表面最外层的膜蛋白，具有高度免疫原性，直接参与中枢神经系统体液免疫，是实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis,EAE）患者发生脱髓鞘改变的主要免疫靶点。多发性硬化（Multiple Sclerosis,MS）是一种主要累及中枢神经系统的慢性炎性脱髓鞘疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎可以作为多发性硬化的理想动物模型，两者具有相似的病理学特征和脱髓鞘改变[1]。目前大多数学者认为，MS 实质是自身免疫性疾病[2]，发病可能与病毒感染、环境、遗传因素以及免疫学因素有关，其中免疫学因素起着关键作用[3]。即使目前对于控制MS 病情已经有许多方法，但是根治性治疗的药物尚未发现[4]。我们团队的前期研究显示，MOG35-55 多肽可以缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的症状，使临床评分降低，且T 淋巴细胞定向迁移可以诱导小鼠胸腺萎缩[5]。在本次研究中，我们制备实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型，并予MOG35-55，观察中枢神经系统和脾效应性T 细胞（Effector T Cell,Teff）的表达变化，探讨MOG35-55 预防实验性自身免疫性脑脊髓炎的免疫学机制，以为临床治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎提供理论依据。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6 小鼠共50 只，6～8 周龄，体质量20～25 g，由北京维通利华实验动物中心提供（许可证号：11400700058264）。小鼠饲养于河南省实验动物中心，温度20～25℃，相对湿度40%～60%。每天观察小鼠状态。

1.2 试剂与仪器 MOG35-55 溶液（1.50 mg/ml）购自上海吉尔生化公司，不完全弗氏佐剂和热灭活的结核分支杆菌溶液（5 mg/ml）由美国BD Difco 公司提供，百日咳毒素（Pertussis Toxin,PT）由北京联立信生物技术有限责任公司提供。Anti-CD4-FITC、Anti-CD8-PE、Anti-CD44-APC、Anti-CD62L-PreCP等流式抗体由eBioscience 公司提供，Mouse IFN-γ ELISA assay kit、Mouse TNF-α ELISA assay kit、Mouse IL-17 ELISA assay kit 购买于R&D Systems公司。

1.3 动物分组与模型制备（1）动物分组：50 只C57BL/6 小鼠采用随机数字表法随机抓取45 只制备实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，余5 只为空白对照组（对照组）。（2）模型制备：将MOG35-55 溶液与灭活的结核杆菌素溶液以体积比1:1 充分混合乳化，EAE 组小鼠于双侧背部皮下注射200 μl，注射当天和注射第2 天于尾静脉注射百日咳毒素200 μg，制备实验性自身免疫性脑脊髓炎模型。模型小鼠的病程特点为进展期病情进展迅速，发病高峰期临床评分稳定且维持3 d 不变为准。第6 天开始给予模型小鼠MOG35-55 多肽[50 μg/200 μl 磷酸盐缓冲液（PBS）]，随机抓取20 只小鼠作为MOG 组，每天一次性腹腔注射，连续注射10 d。剩余的25 只小鼠不做处理，为EAE 组。对照组小鼠仅于双侧背部皮下注射PBS 200 μl，注射当天和注射第2 天于尾静脉注射磷酸盐缓冲液200 μl。

1.4 临床评分 采用Kono's 5 分法对小鼠进行临床评分[6]，从第2 天开始每天观察小鼠并记录小鼠状态。0 分，正常，无临床症状；0.5 分，尾部部分瘫痪；1 分，尾部完全瘫痪；1.5 分，单侧后肢无力；2 分，双侧后肢无力；2.5 分，单侧后肢瘫痪；3 分，双侧后肢完全瘫痪；3.5 分，双侧后肢完全瘫痪，单侧前肢瘫痪；4 分，四肢完全瘫痪；4.5 分，濒死状态；5 分，死亡。

1.5 HE 染色 第16 天取EAE 组小鼠脊髓组织切片进行HE 染色，同时取MOG 组小鼠脊髓组织进行HE 染色，每组3 只小鼠。2%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉小鼠，待小鼠麻醉完全后，以40 g/L 多聚甲醛溶液灌注心脏处死小鼠，切取脊髓组织，固定、脱水、石蜡包埋，制备厚度不少于7 μm 的切片，行HE 染色，观察脊髓组织淋巴细胞浸润和脱髓鞘改变。

1.6 不同组织淋巴细胞计数 EAE 组小鼠选取临床评分2.5～4.0 分的小鼠，同时取MOG 组小鼠，每组3 只。心脏灌注处死小鼠，切取脑和脊髓组织、淋巴结（dLNs）和脾（SP），采用ACK 裂解液裂解红细胞，密度梯度离心法，转速1 900 r/min，离心20 min，然后轻轻吸取中间层悬状物（勿要吸取到Percoll 分离液），置于15 ml 离心管中，加入3～4 倍体积的PBS，转速1 700 r/min，离心5 min，倒掉上清液，加入PBS 重悬，制备单个核细胞悬液，于显微镜下记录T 淋巴细胞计数。

1.7 流式细胞术分析淋巴细胞表型 EAE 组小鼠选取临床评分2.5～4.0 分的小鼠，同时取MOG 组小鼠，每组4 只，首先取各组细胞计数约2×106个细胞，PBS 重悬，离心5 min，弃上清，收集细胞，加入抗 小 鼠 CD4-FITC、CD8-PE 抗 体，CD44-APC、CD62L-PerCP，进行染色。然后流式细胞术检测。利用FlowJo 软件对流式结果进行分析，观察小鼠脾脏及CNS 浸润细胞CD4、CD8、CD44、CD62L 的表达情况。

1.8 酶联免疫吸附试验检测细胞因子表达变化在第15 天时EAE 发病高峰期选取EAE 组小鼠临床评分2.5～4.0 分的小鼠，同时取MOG 组小鼠进行试验，每组4 只，然后同时提取两组小鼠脾淋巴细胞，置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基，37℃和5%二氧化碳环境下培养72 h，取上清液。酶联免疫吸附试验检测细胞因子白细胞介素-17（IL-17）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism7.0 统计软件进行数据处理与分析。呈正态分布的计量资料以表示，采用两独立样本的单因素方差分析，两两比较行LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EAE 小鼠模型诱导成功 在没有注射MOG多肽的情况下，小鼠诱导第9 天后显示出临床症状[最高临床评分为（3.7±0.3）分]，并且伴有严重的脾脏和淋巴结萎缩（见图1）。C57BL/6 小鼠双侧背部皮下注射MOG35-55 多肽乳化剂免疫，尾静脉注射PT后，EAE 小鼠病程经历进展期，到达发病高峰期，出现典型的运动系统障碍的症状，EAE 小鼠发病高峰期脊髓组织切片HE 染色显示大量炎症细胞浸润（见图2）。以上表明EAE 小鼠模型诱导成功。

图1 EAE 组和MOG 组小鼠临床评分

图2 EAE 组和MOG 组小鼠脊髓病理切片（HE，10×40）

2.2 T 淋巴细胞计数 MOG 组小鼠完全阻止了EAE 的发展和淋巴结的萎缩。SP、dLNs 及CNS 中T淋巴细胞计数见表1。随着EAE 阻止，在MOG 组中，CNS 中极少有T 淋巴细胞浸润，MOG 组：（1.5±0.2）×106个；EAE 组：（4.2±0.9）×106个（P＜0.01）。

表1 MOG 组和EAE 组小鼠SP、dLNs 和CNS 中T 淋巴细胞计数（个，±s）

表1 MOG 组和EAE 组小鼠SP、dLNs 和CNS 中T 淋巴细胞计数（个，±s）

2.3 脾脏及中枢神经系统T 淋巴细胞表型流式细胞术分析 EAE 组和MOG 组CNS 浸润的T 淋巴细胞均由效应T 细胞（CD44highCD62Llow）和记忆T细胞（CD44highCD62Lhigh）构成：EAE 组CD4+细胞中CD44highCD62Llow占 71.5%，CD8+细 胞 中CD44highCD62Llow占68.2%；MOG 组CD4+细 胞 中CD44highCD62Llow占 73.4%，CD8+细 胞 中CD44highCD62Llow占66.9%。EAE 组脾脏中的CD4+细胞和CD8+细胞均是CD44-细胞占大多数，其中CD4+细胞中CD44-CD62Llow占50.3%、CD44-CD62Lhigh占4.88%，CD8+细胞中CD44-CD62Llow占49.7%、CD44-CD62Lhigh占11.4%；MOG 组中CD4+细胞和CD8+细胞均是CD44+细胞占大多数，其中CD4+细胞中CD44-CD62Llow占37.0%、CD44-CD62Lhigh占26.1%，CD8+细 胞 中CD44-CD62Llow占9.42% 、CD44-CD62Lhigh占47.6%。所以EAE 诱导之后，脾脏中CD4+和CD8+T 细胞被激活，但是只有较少的CD44highT 细胞群浸润到了CNS。

2.4 细胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌情况ELISA 分析 ELISA 分析发现与EAE 组相比，MOG 组细胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌均高于EAE 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 细胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌情况ELISA 分析

3 讨论

本实验发现在第9 天EAE 组出现了典型的临床症状，并伴有严重的脾脏和淋巴结萎缩，EAE 诱导后脾脏和dLNs 淋巴细胞数量增加，在EAE 发病前10 d 达到高峰。EAE 组中，随着EAE 小鼠周围淋巴系统中T 细胞的减少，CNS 中T 细胞增多，尤其是CD4+T 细胞。随着MOG 的输注导致更多的T 细胞聚集在脾脏和dLNs 中，而不是CNS 中。在EAE进展过程中，我们还观察到在接种处偶尔出现了皮肤溃疡，文献报道这种形成溃疡的小鼠经常具有抵抗EAE 和淋巴结萎缩的能力[6]。本研究中两组中枢神经系统浸润的 T 淋巴细胞均由效应 T 细胞（CD44highCD62Llow）和记忆T 细胞（CD44highCD62Lhigh）构成。EAE 组脾脏中的CD4+细胞和CD8+细胞均是CD44-占大多数，而MOG 组中CD4+细胞和CD8+细胞均是CD44+细胞占大多数。说明EAE 诱导之后，脾脏中CD4+和CD8+T 细胞被激活，但是只有较少的CD44highT 细胞群浸润到了CNS。综上所述，可溶性MOG 可能是通过阻止效应T 细胞向中枢神经系统迁移而实现预防EAE 的发生和淋巴组织的萎缩。