张娟娟，傅 翔，朱全刚，张立超

(1.上海市中医医院药剂科，上海 200071；2.上海市浦东新区新场社区卫生服务中心，上海 201314；3.上海市控江医院药剂科，上海200093；4.上海市皮肤病医院药剂科，上海200443)

微针是一种高效、安全、新型的经皮促透技术，已广泛应用于皮肤美容、局部麻醉、免疫接种、蛋白质和多肽类给药、DNA 给药等多个领域[1]。课题组前期将美容行业已使用多年的滚轮微针引入至醋酸曲安奈德的瘢痕裸鼠模型行皮肤治疗，其无痛、均匀、便捷、可用于大张皮给药等特点，有针对性地克服了瘢痕皮内注射给药存在的诸多缺点[2]。为解决市售滚轮微针无法控制力度均匀性、给药重现性差等问题，课题组又改装了市售滚轮微针并进行了性能评价[3]。

目前国内外均未见滚轮微针处理方法和处理次数的相关标准规范，不同文献处理方法各异，分为单方向处理、垂直方向处理和垂直交叉4个方向处理，处理次数一般在50次以下。Zhou等[4]使用滚轮微针垂直方向各滚动10次用于糖尿病大鼠的胰岛素促透给药；Yoon等[5]单方向处理50次；Badran等[6]则使用滚轮微针垂直交叉4个方向各3次；You等[7]单方向和4个交叉方向使用1、3、6、9次，并证明了4个交叉方向滚轮微针处理较单方向促透效果好。而用于美容的市售滚轮微针说明书则显示，其处理方法是垂直交叉4个方向各10次。为此，课题组采用垂直交叉4个方向处理，以药物渗透效果、分布均匀性和皮肤刺激性为指标，评价滚轮微针在维A酸裸鼠皮肤促透中安全、有效的滚轮微针处理次数。

1 仪器、试剂和实验动物

滚轮微针(540针，针长500 μm，美国Clinical Resolution Laboratory)；SPD-10AVP高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Franz扩散池(中国科学院上海有机化学所)；FluoView FV1000激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)；TEWL测量仪(芬兰Delfin公司)；Powerlab/8sp激光多普勒血流仪(澳大利亚AD Instruments公司)；Canon 70D数码相机(日本佳能公司)；TGL-18B离心机(上海安亭科学仪器厂)；万分之一电子分析天平(上海精科天平)。

维A酸对照品(99.4%，批号：100307-200902，中国食品药品检定研究院)；维A酸乳膏(0.025%，批号：1204091，南京臣功制药股份有限公司)；亚甲基蓝(上海研域化学试剂有限公司)；龙胆紫(上海恒远生物科技有限公司)；FITC(北京Solarbio科技有限公司)；甲醇、异丙醇为色谱纯；冰乙酸、乙醇、三乙醇胺、戊巴比妥钠等其他试剂均为分析纯。

BALB/c裸鼠(6～8周，雄性，上海斯莱克实验动物有限公司/中科院上海实验动物中心)。

2 实验方法

2.1 维A酸的含量测定

参见文献[8]。

2.2 体外渗透实验

2.2.1离体皮肤的处理

裸鼠拉颈处死后取下背部皮肤，去除皮下脂肪组织，用生理盐水漂洗干净，-20 ℃保存，2周内使用。

2.2.2透皮接收液的制备

对照组皮肤不用微针处理，实验组皮肤置于电子天平的托盘上，用540针滚轮微针沿4个交叉方向处理(滚动方向见文献[8])，分别处理1、3、5、8、10次，控制力度为350～400 g(力度控制方法见文献[3])。分别将对照组与实验组裸鼠皮肤的角质层朝上，固定于Franz扩散池的给药室与接收室之间。将0.3 g维A酸乳膏涂抹于鼠皮角质层上(有效面积为0.85 cm2)，向接收室中加入接收液异丙醇-生理盐水(1∶1)直至与皮肤紧密接触，排除气泡，置于(37.0±0.5)℃恒温水浴中，以300 r/min恒速电磁搅拌。分别于2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48 h各取出0.2 ml接收液(取液后迅速补充等量接收液)，HPLC法测定含量，累积渗透量按文献[14]计算。

2.2.3皮肤样液的制备

实验结束后，取下皮肤有效扩散部位，用蘸有乙醇的棉签擦净表面残留药物。采用组织匀浆法，取给药部位皮肤，剪碎匀浆，加入1 ml空白接收液，超声提取20 min，涡旋振荡3 min，在11 000×g离心10 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC法测定含量。整个过程应避光操作。

2.3 分布均匀性实验

2.3.1亚甲基蓝染色观察

采用新鲜的离体裸鼠背部皮肤置于泡沫塑料平板上，四周用大头钉固定，尽量使皮肤保持自然状态下的张力。按前述方法4个交叉方向分别处理不同次数后，用亚甲基蓝染液染色2 min，随后清水洗去染液，纱布擦去皮肤表面的残余染料和水分，用数码相机拍照观察微针不同处理次数时微针孔的分布情况。

2.3.2激光共聚焦显微镜观察

离体裸鼠皮肤不同次数处理后，按照Franz扩散池实验方法将1%FITC溶液加入给药室，实验进行12 h后取下皮肤，擦去多余药液，用激光共聚焦显微镜观察在488 nm激发波长下荧光素在皮肤内的分布。

2.3.3皮肤内药物吸收实验

裸鼠6只，皮肤消毒后背部两侧各标记出对称的1 cm×1 cm区域，两区域间隔3 cm，分别处理1、3、5、8次，给予0.1 g维A酸乳膏。给药12 h后裸鼠拉颈处死，取下背部涂药区域皮肤。用蘸有乙醇的棉签擦净表面残留药物，每隔100m冰冻切片，按照“2.2.3”项下方法测定皮肤滞留药量。

2.4 皮肤刺激性实验

2.4.1TEWL测量法

取裸鼠6只，采用1%戊巴比妥钠注射液(剂量按75 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，背部消毒后分别标记约1 cm2圆形区域，25℃、相对湿度60%，稳定30 min，按前述处理方式分别处理1、3、5、8、10次，对照组不做处理。处理前测定基础值，分别于处理后0、20、40、60、80、100、120 min，以及3、4、6、8、12、24、36、48 h将探头轻轻按压于所标记区域，记录数据。

2.4.2激光多普勒血流量法

裸鼠5只按照前述方法麻醉后编号，25℃、相对湿度60%，稳定30 min。背部消毒后分别标记约1 cm2圆形区域，标记区域避开大血管。分别用滚轮微针处理1、3、5、8、10次，分别于处理前、处理后0、20、40、60、80、100、120 min内测定皮肤血流量。处理前为基础血流值，血流量以血流灌注单位(blood perfusion units，BPU)为单位。

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 体外渗透效果

微针处理不同次数后维A酸的渗透效果，见表1。微针处理次数越多，促透效果越好。1、3、5、8、10次维A酸的48 h累积渗透量分别为对照组的1.74、2.08、2.56、2.85、3.06倍，渗透速率分别为对照组的1.75、2.17、2.58、3.00、4.08倍；皮肤中滞留药量分别为对照组的1.27、1.85、2.28、2.78、2.80倍。与微针处理8次相比，微针处理10次的48 h累积渗透量和渗透速率均具有显著性差异(P<0.05)。但是，两者在皮肤中滞留药量无显著性差异(P>0.05)。

表1 微针处理次数对维A酸渗透效果及皮肤滞留药量的影响

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与处理8次组比较

3.2 分布均匀性

3.2.1亚甲基蓝染色和激光共聚焦实验

微针不同处理次数对渗透分布的影响，见图1。亚甲蓝染色结果(图1A)可见微针处理次数较少时，微针孔较少且分布不均，并且由于皮肤弹性等问题会造成有些部位微针孔不明显甚至没有(图1Ab、图1Ac)，随着微针处理次数不断增加，微针孔逐渐密集且均匀分布度提高，微针处理5次以上时，出现部分针眼重叠而皮肤破损现象；激光共聚焦检测荧光素FITC结果(图1B)与图1A类似，随着微针处理次数的增加，药物渗透点逐渐增多并趋于均匀。

图1 微针不同处理次数时裸鼠皮肤的渗透分布 A.亚甲基蓝染色图；B.激光共聚焦测试图；a.空白对照组；b.1次组；c.3次组；d.5次组；e.8次组；f.10次组

3.2.2在体皮肤内药物吸收实验

给药12 h，微针分别处理1、3、5、8次对裸鼠皮肤内维A酸吸收均匀度的影响结果见图2。1 cm×1 cm面积的裸鼠背部皮肤，每100 μm予以均匀切片，共获得10张切片，测定皮肤中药物含量发现，微针处理1、3、5、8次，皮肤中滞留药量均值分别为(0.17 ± 0.07)μg、(0.23 ± 0.05)μg、(0.32 ± 0.07)μg、(0.39 ± 0.08)μg，其皮肤中滞留药量范围分别为0.06～0.41 μg、0.14～0.33 μg、0.27～0.38 μg、0.33～0.45 μg。以上结果表明，微针处理1次时裸鼠皮肤中维A酸药物滞留量均匀度相对较差，但是微针处理3次以上时，皮肤中滞留药量的均匀度明显提高。

图2 微针不同处理次数对裸鼠皮肤内维A酸吸收均匀性的影响

3.3 皮肤刺激性

3.3.1TEWL测量法

微针不同处理次数对皮肤水分流失的影响，见图3。微针处理后皮肤水分流失量均有所增加，处理1次、3次时，TEWL值仅微弱增加，平均失水量增加(19.01 ±5.54)和(26.60±4.38)g/(m2·h)。但是当微针处理皮肤5次或8次时，TEWL值分别显著增加至(67.82 ±8.75)和(93.17 ±11.23) g/(m2·h)。使用10次时达到最高值，为(122.02 ±14.90)g/(m2·h)。由图3可见，各处理组TEWL值均在微针处理后瞬间增至最高，而后逐渐下降并缓慢恢复基线。处理1、3、5次恢复基线时间为24 h，微针处理8次、10次后36 h恢复基线。

图3 微针不同处理次数对裸鼠皮肤TEWL值的影响

观察皮肤表面发现，处理次数为1次、3次、5次时，仅出现轻、中度红斑，且24 h内褪去。处理次数为8次和10次时，裸鼠处理部位皮肤在第2天出现炎症反应，皮肤增厚，而5次及以下未见该现象。

3.3.2激光多普勒血流量法

微针不同处理次数对裸鼠皮肤血流量的影响，见图4。随着微针处理次数的增加，皮肤血流量均不同程度的增加。微针使用1次和3次时，皮肤血流量增加较少，分别为(5.31±0.89)BPU和(10.27±1.40)BPU，但是20 min后恢复基线值。处理次数为5、8、10次时，皮肤血流量迅速急剧增加，除了8次、10次组在2 h恢复正常血流外，其余处理组均在1 h内恢复基线。

图4 微针不同处理次数对裸鼠皮肤血流量的影响

4 讨论

滚轮微针处理1、3、5、8、10次时，处理次数越多，裸鼠皮肤的维A酸促透效果越好，皮肤中滞留药量也越高，但是皮肤中滞留药量在处理8次和10次时无显著性差异(P>0.05)。亚甲基蓝染色和激光共聚焦实验均显示处理次数增加，针孔分布均匀度提高。在体皮肤内药物吸收实验显示，处理1次时裸鼠皮肤中滞留药量均匀性较差，但是处理3次以上时皮肤中滞留药量均匀性明显改善。上述实验表明，滚轮微针处理次数越多，裸鼠皮肤药物的促透作用越好[9]。亚甲基蓝染色结果显示，处理5次以上时，出现部分针眼重叠而皮肤破损现象。TEWL测量法和激光多普勒法分别通过皮肤表面失水量和皮肤血流的变化考察皮肤的受刺激程度。TEWL测量法显示处理5次以下皮肤保护水分流失的屏障功能恢复时间为24 h，处理8次以上为36 h。激光多普勒血流量检测结果显示，处理5次以下对皮肤血流刺激影响的恢复时间为1 h，处理8次以上为2 h。以上结果说明，滚轮微针处理次数5次以下时，裸鼠皮肤的屏障功能破坏程度较小，即皮肤刺激性较低。综上，基于安全性和有效性，课题组认为采用滚轮微针4个交叉方向各使用5次，相对较为适合裸鼠皮肤的促透研究[9]。本实验主要对比微针处理不同次数对皮肤的刺激性影响，为避免药物对结果的影响，考察刺激性时各组均未给予维A酸乳膏。

维A酸是临床常用的皮肤治疗药物，具有调节表皮细胞分化和增殖、抑制皮脂腺分泌、抗炎、抑制皮肤光老化等作用，是主要的治疗痤疮药物[10]。该药物自身具有荧光性，在405 nm激发波长下可显示蓝色荧光，因此，实验选用维A酸为模型药物进行激光共聚焦显微镜观察(CLSM)扫描实验。但是，均匀性实验过程中发现，维A酸的荧光淬灭迅速，需严格避光条件以及迅速确定位点进行扫描，而本实验时间较长且条件有限，拍摄结果并不理想。故均匀性实验部分CLSM换用FITC荧光素，可较长时间操作和拍摄[11]。

采用TEWL测量法、激光多普勒血流量法评价皮肤刺激性，是多角度评价皮肤刺激性的经典方法，分别通过皮肤表面失水量和皮肤血流的变化考察皮肤屏障接受刺激的程度[2]。