彭镰心,杨 雯,魏丽娟,,姚镇东,,陈杨洁,赵 钢

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106; 2.成都中医药大学药学院,四川成都 611130; 3.成都大学,农业部杂粮加工重点实验室,四川成都 610106)

荞麦属蓼科,主要栽培种有甜荞(FagopyrumesculentumMoench)和苦荞(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn),为一年生栽培植物。甜荞分布广阔,在我国主要分布于长江以北的各省区,常年栽培品种有150多个[1-3];甜荞含有丰富的蛋白质、均衡的氨基酸以及酚酸类、黄酮类、糖醇类等酚类成分,具有抗氧化、降血压、降低毛细血管脆性等方面的药理功效[4-6]。

萌发的甜荞具有更高质量的营养,酚类成分显著增高[10-12],甜荞芽酚类成分主要是黄酮类成分,有抗氧化、抗菌、抗病毒等功能[13-14],因此是功能食品开发的重要新型原料。然而,目前甜荞芽主要通过检测芦丁成分含量进行质量控制[15-16],专属性不强;同时不同品种、不同发芽时间甜荞芽中酚类成分的积累规律不明确,不利于甜荞芽的开发利用。

针对此问题,本实验采用超高效液相色谱对不同流速、波长、流动相进行了考察,进行5种酚类成分(荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁)的方法学考察,建立了甜荞芽中5种酚类成分的同时测定方法;采用高效液相色谱法测定了甜荞芽中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量,以此评价甜荞芽质量。最后,比较7种甜荞芽的2个采收阶段(第7、10 d)品种之间含量的差异,以期为甜荞芽营养品质的研究和质量控制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁荞1号、品甜2号、红花甜荞、赤甜1号、定甜3号、丰甜1号、宁甜1号 农业部杂粮加工重点实验室(成都大学),产地为四川省成都市金堂县,采收期为2018年6月;荭草素对照品(批号:waq-16041301)、异荭草素对照品(批号:wak-16080404)、牡荆素对照品(批号:130522),异牡荆素对照品(批号:wak-16082004)、芦丁对照品(批号:wak-16031602) 纯度均大于98%,四川维克奇生物科技有限公司;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品(批号:MUST-16070804)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷对照品(批号:MUST-20161115) 纯度均大于98%,成都曼斯特生物科技有限公司;甲醇 色谱纯,安徽天地高纯溶剂有限公司;冰乙酸 色谱纯,成都市科龙化工试剂厂;甲酸 分析纯,成都市科龙化工试剂厂;水 重蒸馏水;其余试剂 均为国产分析纯。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(QSM四元泵、SM-FTN进样器、CH-A柱温箱、PDA检测器) 沃特世上海科技有限公司;高效液相色谱仪(SPD-20A检测器、DGU-20A5R脱气机、SIL-20A进样器、LC-20AT输送单元) 日本岛津仪器公司;FD-2真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有点公司;DFT-100型手提式高速粉碎机 温岭市林大机械有限公司;CP224C十万分之一电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;0SHZ-95B型循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;DW-HL218型超低温冷冻储存箱 中科美菱低温科技有限责任公司;H2050R高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;GL-88B旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜荞芽的制备 挑选颗粒饱满、大小均一甜荞粒,清洗、除杂、于纯净水中浸泡24 h(料液比约为1∶3),将浸泡好的甜荞粒置于铺有营养土的育苗盘中,在温度25 ℃、湿度80%的人工气候箱中黑暗放置7 d,再放置于相同温度、湿度和每天光照12 h的条件下培养3 d,定时喷水,分别于第7、10 d采收;采用真空冷冻干燥机对甜荞芽进行干燥,粉碎过80目筛,避光冷藏备用[17]。

1.2.2 酚类的提取及测定

1.2.2.1 酚类成分对照品的制备 分别精密称定对照品荭草素0.00770 g、异荭草素0.00132 g、牡荆素0.00898 g、异牡荆素0.00810 g、芦丁0.00720 g,分别置于10 mL棕色容量瓶中,加无水甲醇溶解并定容至10 mL,制成标准品储备液,其浓度分别为荭草素770.00 μg/mL、异荭草素132.00 μg/mL、牡荆素898.00 μg/mL、异牡荆素810.00 μg/mL、芦丁720.00 μg/mL。分别取标准品储备液适量置于10 mL棕色容量瓶,加无水甲醇定容至10 mL,制成荭草素38.50 μg/mL、异荭草素26.40 μg/mL、牡荆素44.90 μg/mL、异牡荆素40.50 μg/mL、芦丁36.00 μg/mL的混合标准品溶液,于4 ℃保存,备用。

1.2.2.2 甜荞芽粉中多酚成分的提取 精密称定甜荞芽粉0.100 g样品于100 mL锥形瓶中,加95%甲醇水溶液20 mL,摇匀并称重,60 ℃超声处理30 min,取出冷却至室温,用95%甲醇水溶液补足质量,摇匀,12000 r/min离心15 min,取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤,取过滤液,待测[18]。

1.2.2.3 甜荞芽中多酚测定色谱条件 ACQUITYUPLC® BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱;流动相:甲醇(A)-0.20%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脱:0～3 min,10%～26%A;3～5 min,26%～29%A;5～9.5 min,29%～38%A;9.5～13 min,38%～44%A;13～15 min,44%A;15～17 min,44%～10%A;检测波长为254 nm;柱温为35 ℃;流速为0.20 mL/min;进样量1 μL[19]。

1.2.3 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷的提取和测定

1.2.3.1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷对照品的制备 精密称定对照品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.00390 g、矢车菊素-3-O-芸香糖苷0.00200 g分别置于10 mL棕色容量瓶中,加5%甲酸水溶液溶解并定容至10 mL,制成标准品储备液,其浓度分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷390.00 μg/mL、矢车菊素-3-O-芸香糖苷200.00 μg/mL。分别取标准品储备液适量置于10 mL棕色容量瓶,加5%甲酸水溶液定容至10 mL,制成含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷39.00 μg/mL、矢车菊素-3-O-芸香糖苷20.00 μg/mL的混合标准品溶液,于4 ℃保存,备用。

1.2.3.2 甜荞芽中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷的提取 分别精密称取甜荞芽粉1.000 g于100 mL锥形瓶中,避光条件下添加5%甲酸水溶液25 mL,摇匀并称重,60 ℃超声处理30 min,取出冷却至室温,用95%甲醇水溶液补足质量,摇匀,漩涡振荡5 min,12000 r/min(4 ℃)冷冻离心15 min,取上清液,0.45 μm微孔滤膜过滤,取过滤液,待测[20]。

1.2.3.3 甜荞芽中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷测定色谱条件 Global-ODSC18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:A(水∶甲酸=95∶5,V/V),B(乙腈∶甲酸=95∶5,V/V);梯度洗脱:0～5 min,10%～13%B;5～7 min,13%～15%B;7～9 min,15%B;9～10 min,15%～10%B;10～20 min,10%B;检测波长为520 nm;柱温为40 ℃;流速为1.0 mL/min;进样量10 μL[20]。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性关系考察 精密吸取“1.2.2”项下混合对照品溶液适量,置于10 mL容量瓶中,加95%甲醇水溶液定容至刻度,摇匀配成不同质量浓度的混合对照品溶液,按“1.2.3”项下色谱条件测定,每个浓度分别进样3次,取平均值,以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y),绘制荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的标准曲线,得到各成分的回归方程及线性范围。

1.2.4.2 精密度考察 取荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁对照品适量,按“1.2.2”项下混合标准品的制备方法制备混标,按“1.2.3”项下色谱条件测定,连续进样6次,记录荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的峰面积积分值,以峰面积分别计算相对标准偏差(RSD)。

1.2.4.3 重复性考察 取甜荞芽粉末样品(过80目筛)6份,按“1.2.3”项下样品溶液的制备方法制备甜荞芽提取液,按“1.2.4”项下色谱条件测定,记录荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的峰面积积分值,以峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.4 稳定性考察 取甜荞芽粉末样品,按“1.2.3”项下样品溶液的制备方法制备甜荞芽提取液,精密吸取同一样品溶液,分别在0、4、6、8、12、24 h进样1 μL,按“1.2.4”项下色谱条件测定,记录荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的峰面积积分值,按峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.5 加样回收率考察 取已知含量甜荞芽样品粉末,精密称取样品约1.00 g,共6份,分别加入荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁对照品适量,按“1.2.3”项下供试品的制备方法制备提取液,按“1.2.4”项下色谱条件测定。计算荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的平均加样回收率和RSD值。

1.3 数据处理

每个实验独立重复3次,结果以平行测定所得的平均值表示,采用DPS 14.50配对t检验进行显著性分析,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 多酚成分对照品和样品色谱图

预实验对柱温(33、35、37 ℃)、波长(252、254、256 nm)、流速(0.15、0.20、0.25 mL/min)、流动相等条件进行了考察,结果表明最佳色谱条件如下:ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱;流动相:甲醇(A)-0.20%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脱:0～3 min,10%～26% A;3～5 min,26%～29% A;5～9.5 min,29%～38% A;9.5～13 min,38%～44% A;13～15 min,44% A;15～17 min,44%～10% A;检测波长为254 nm;柱温为35 ℃;流速为0.20 mL/min;进样量1 μL。色谱条件经过优化后,多酚混合对照品溶液色谱图(A)和样品色谱图(B)如图1所示。由图1可知,甜荞芽中荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁5种酚类成分的分离良好,出峰时间分别为:6.535、6.772、7.438、8.234、8.660 min。

图1 多酚混合对照品溶液色谱图(A)和样品色谱图(B)Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard solution(A)and control sample(B)注:1.荭草素;2.异荭草素;3.牡荆素;4.异牡荆素;5.芦丁。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察结果 通过线性回归分析,得到各成分的回归方程式和线性范围,如表1。结果表明,荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁分别在77.00～770.00、13.20～132.00、89.80～898.00、81.00～810.00、72.00～720.00 μg/mL范围内线性关系良好(R2>0.999)。

表1 甜荞芽中5种酚类成分的标准曲线Table 1 Standard curve of five polyphenols components in buckwheat sprouts

2.2.2 重复性、稳定性、精密度与回收率考察结果 荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的精密度、重复性、稳定性、相对保留时间、加样回收率的相对标准偏差均小于2%,由此可知超高效液相仪的精密度良好,甜荞芽酚类成分重复性良好,酚类成分在24 h内稳定;5种酚类成分的回收率在95%～105%之间,说明甜荞芽酚类成分的提取方法准确可靠,结果见表2。

表2 精密度、稳定性、重现性与回收率考查结果Table 2 Investigation results of precision,stability,reproducibility and recovery rate

2.3 甜荞芽中酚类成分的含量

避光发芽第7、10 d,不同品种甜荞芽中酚类成分含量测定结果分别如图2、图3所示,不同甜荞芽品种间总酚含量测定结果如图4所示。

图2 甜荞芽第7d不同品种间酚类的比较Fig.2 Comparison of phenols on the 7th day in different buckwheat sprouts注:不同字母表示7种甜荞芽品种之间 有显著性差异(P<0.05),图3、图4同。

图4 不同甜荞芽品种间总酚含量的比较Fig.4 Comparison of total phenol content in different varieties of buckwheat sprouts

由图2可知,避光发芽第7 d,7种甜荞芽中的4种酚类成分(荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁)品种之间具有明显差异,含量最高的品种都是赤甜1号,分别为8.03、3.18、23.28、5.28 mg/g,含量最低的品种都是宁荞1号,分别为3.91、1.46、10.95、2.14 mg/g;7种甜荞芽中的异荭草素品种之间除了定甜3号和丰甜1号无显著性差异外,其余品种皆有显著性差异(P<0.05),其中含量最高的品种是赤甜1号,3.89 mg/g,含量最低的品种是宁荞1号,1.99 mg/g;不同品种之间总酚(5种酚类成分的总和)也有显著性差异(P<0.05)(如图4),含量最高的是赤甜1号,43.66 mg/g,含量最低的是宁荞1号,20.45 mg/g。

避光发芽第10 d,不同品种甜荞芽中酚类成分含量测定结果如图3,由图3可知,除品甜2号和红花甜荞中的牡荆素和异牡荆素没有显著性差异外,其余品种之间各成分有显著差异(P<0.05),5种酚类成分中含量最高的品种都是品甜2号,分别为7.74、3.89、2.78、20.98、5.41 mg/g,含量最低的是定甜3号,分别为2.96、1.47、0.98、7.16、1.56 mg/g;由图4可知,总酚含量最高的是品甜2号,为40.82 mg/g,最低的是定甜3号,为14.13 mg/g。

2.4 不同品种矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量

避光发芽第7、10 d,不同品种甜荞芽中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量测定结果分别如图5、图6所示,不同甜荞芽品种矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷总含量测定结果如图7所示。

图5 甜荞芽第7d矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量的比较Fig.5 Comparison of content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin on the 7th day in buckwheat sprouts

图6 甜荞芽第10d矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量的比较Fig.6 Comparison of content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin on the 10th day in buckwheat sprouts

图7 不同甜荞芽品种间矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷总含量的比较Fig.7 Comparison of the content of total content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin among different varieties of buckwheat sprouts

由图5可知,避光发芽第7 d,7种甜荞芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量都高于矢车菊素-3-O-芸香糖苷,其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量最高的都是红花甜荞,分别为159.36、59.11 mg/kg,最低的是赤甜1号,分别为39.41、10.50 mg/kg;由图7可知,7种甜荞芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷的总含量具有显著差异(P<0.05),含量最高的是红花甜荞,218.47 mg/kg,最低的是赤甜1号,为49.91 mg/kg。

由图6可知,避光发芽第10 d,除宁甜1号和品甜2号没有显著性差异,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷2种酚类成分在其他品种之间皆有显著性差异(P<0.05),其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量最高的是宁甜1号,220.14 mg/kg,最低的是丰甜1号,68.66 mg/kg;矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量最高的是红花甜荞,50.14 mg/kg,最低的是品甜2号,19.61 mg/kg;由图7可知,7种甜荞芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷总含量具有显著差异(P<0.05),其中含量最高的是宁甜1号,282.95 mg/kg,最低的是丰甜1号,88.35 mg/kg。

3 结论

本实验建立了甜荞芽中荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁的超高效液相色谱检测方法,考察了5种酚类成分的重复性、稳定性、精密度以及回收率,结果相对标准偏差均小于2%,回收率分别为99.64%、98.68%、101.83%、98.61%、103.70%,在95%～105%范围之内,表明甜荞芽中5种酚类成分分离良好、各组分色谱峰的峰形对称、仪器精密度良好。方法学考察表明,本文所建立的甜荞芽5种酚类成分的超高效液相色谱测定方法准确可靠,可供甜荞芽中5种酚类成分的快速准确定量。通过测定7种甜荞芽在第7、10 d酚类成分的含量可知,不同的品种之间酚类成分存在差异,其中第7 d甜荞芽中5种酚类成分(荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁)总含量最高的品种是赤甜1号,为43.66 mg/g，最低的品种是宁荞1号，为20.45 mg/g;第10 d甜荞芽中5种酚类成分总含量最高的品种是品甜2号,为40.82 mg/g,最低的品种是定甜3号，为14.13 mg/g;第7和第10 d矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷总含量最高的分别是红花甜荞、宁甜1号,为218.47、282.95 mg/kg,最低的分别是赤甜1号、丰甜1号,为49.91、88.35 mg/kg。由此可见,不同的甜荞芽品种之间各酚类成分的含量具有一定的差异,本结果可为甜荞芽的选育提供参考。